薯蕷皂苷對博萊霉素誘導的大鼠肺纖維化的保護作用研究

尹連紅 許麗娜 彭金詠

特發性肺間質纖維化(Idiopathic Pulmonary fibrosis, IPF)是一種呈進展性和致死性的彌漫性肺間質疾病，早期以肺泡炎癥為特征，后期發展至大量成纖維細胞異常增殖和細胞外基質大量沉積[1-2]。博萊霉素(Bleomycin, BLM)是一種廣譜抗腫瘤藥物，在使用后期會導致肺纖維化癥狀，被廣泛用于肺纖維化模型的相關研究。薯蕷皂苷(Dioscin, Dio, 圖1)廣泛存在于薯蕷科、石竹科、薔薇科和百合科等植物中，屬于三萜皂苷類化合物。薯蕷皂苷具有多種藥理學活性，如抗炎、抗氧化、抗腫瘤、抗感染、降血脂及肝保護作用等[3]，其通過抗氧化應激和抗炎等作用保護急性肝損傷及肝纖維化[4-6]。本研究在BLM誘導的大鼠肺纖維化模型中探討薯蕷皂苷對肺纖維化的影響，并對其作用機制進行初步探討，為肺纖維化的治療提供新的契機。

圖1 薯蕷皂苷化學結構式

資料與方法

一、動物與材料

雄性SD大鼠，體重180～220 g，由大連醫科大學SPF實驗動物中心提供，合格證號：SCXK(遼)2015-0006，室溫22 ± 2℃，濕度55%-70%，自由攝食與飲水。

薯蕷皂苷為本實驗室制備，純度≥98%(與標準品對照)，結構經UV、MS和NMR鑒定[7](圖1)；強的松購自Sigma Chemical Co；蛋白提取試劑盒購自南京凱基生物科技發展有限公司；總抗氧化能力(T-AOC)、羥脯氨酸(HYP)檢測試劑盒，均購自南京建成生物技術公司；BCA蛋白濃度測定和BeyoECL Plus試劑盒均購自碧云天生物技術研究所；甘氨酸、Tris、SDS等購自美國Sigma Chemical Co.；一抗兔源Foxo3a、ICAM-1、P65、TGF-β1、GAPDH、兔源二抗購自武漢三鷹生物技術有限公司。

二、實驗動物分組處理

72只成年雄性SD大鼠(200～220 g)隨機分為6組：生理鹽水對照組(Control)，BLM組(Model)，薯蕷皂苷給藥組(Dio 15、30和60 mg/kg)，強的松陽性對照組(PND 50 mg/kg)。BLM組經氣管單次給予BLM (3 mg/kg)，薯蕷皂苷給藥組和強的松陽性對照組：在BLM處理前7天及處理后30天每24 h灌胃給藥一次，對照組給予等量生理鹽水。用蘇木精-伊紅(H&E)染色，Masson染色，天狼猩紅(Sirius Red)染色檢測肺病理改變。各組動物分別于BLM處理后30天停止給藥。于末次給藥后，大鼠禁食不禁水24 h，眼后靜脈叢取全血經離心得血清。處死大鼠，取出肺組織，測定肺系數，部分肺組織置于10%甲醛溶液中固定，用于組織病理學研究。

三、肺系數及生化指標檢測

肺系數是肺纖維化的一項測量指標，稱定大鼠體重和肺濕重，計算肺系數。肺系數=肺濕重(g)/體重(kg) × 100%。

根據說明書測定血清的總抗氧能力T-AOC，用于評價肺組織損傷程度。

四、肺組織羥脯氨酸(HPY)含量測定

將肺組織勻漿離心后取上清，按HYP試劑盒中的酸水解法說明書，測定每組大鼠肺組織中HYP的含量。

五、Western blot

取肺組織按照試劑盒說明書進行操作，加入裂解液，充分勻漿，然后10000 rpm，4℃離心10 min，收集上清，采用BCA法測定蛋白濃度。組織蛋白與2 × loading buffer (100 μL + 4 μL β-巰基乙醇)按1: 1 (v/v)混勻，煮沸5 min，-80℃分裝保存備用。根據目標蛋白分子量配制適當比例的SDS-PAGE進行電泳；根據目標蛋白的分子量，濕轉轉膜；將載有目標蛋白的PVDF膜放入5%脫脂奶粉中，搖床上室溫封閉3 h。將封閉好的膜用TTBS洗5 min，放入相應比例的一抗中，4℃孵育過夜。TTBS洗膜3次，每次10 min，放入對應的二抗中，搖床上室溫孵育2 h，TTBS洗膜三次，每次10 min?；瘜W發光顯影，并采用Lab Works 4.6專業圖像分析軟件進行圖像分析。

六、統計學分析

結 果

一、大鼠肺系數、T-AOC和HYP的含量

肺系數是反映肺纖維化程度的一個重要指標，如由(圖2A)所示，與Control相比，Model組的肺系數明顯升高，由3.99±0.63上升至5.83±1.16 (P=0.005)；與Model組比較，薯蕷皂苷給藥組(Dio 60 mg/kg，Dio 30 mg/kg)大鼠肺系數明顯降低，Dio 60 mg/kg組可降低至3.59±0.40，差異具有統計學意義(P<0.05)。如由(圖2B)所示，與Control相比，Model組的總抗氧能力顯著升高，由3.23±0.69上升至43.44±12.42 (P=0.0023)；與Model組相比，薯蕷皂苷給藥組顯著降低(P<0.01)，Dio 60 mg/kg組可降低至6.02±0.59。如(圖2C)所示，與Control相比，Model組的HYP的表達量明顯增加(P<0.05)；與Model組相比，14天時薯蕷皂苷給藥組中大鼠肺組織HYP的含量無顯著變化，28天時薯蕷皂苷給藥組大鼠肺組織HYP的含量明顯減少(P<0.05)，且Dio 30 mg/kg組的治療效果與PDN 50 mg/kg組相當。

二、肺組織病理結果

正常大鼠肺組織結構清晰，肺泡壁正常，偶見炎癥細胞，無間質纖維化增生；BLM造模7天結果表明大鼠肺組織病變早期表現為滲出性肺泡炎，炎癥細胞在病變處聚集增多。BLM造模14天時，與Control組相比，BLM組HYP含量明顯升高，由0.57±0.14上升至0.83±0.25(圖2C)。顯微鏡下可見廣泛炎癥細胞浸潤，以淋巴細胞、單核吞噬細胞為主，并有肺泡壁增厚、成纖維細胞增生等Ⅱ級肺泡炎表現。第28天可見肺間質內有大量散在的膠原纖維，肺泡隔增寬明顯，肺泡結構破壞，有許多成纖維細胞等肺間質纖維化病變，即造模晚期為肺間質纖維化，纖維結締組織增生明顯，基質膠原聚集，取代了正常的肺組織結構。隨著時間的變化，肺組織的的炎癥反應程度，纖維化程度及量化結果(如圖3)所示。隨著造模時間的延長，肺纖維化的程度逐漸增加，Masson染色結果中第14天的相對纖維化為6.03±0.85，第28天的相對纖維化為12.77±1.24。Sirius Red染色結果中第14天的相對纖維化為4.91±1.02，第28天的相對纖維化為7.41±1.08。

圖2 薯蕷皂苷對BLM誘導的肺纖維化大鼠的肺系數、 T-AOC和HYP的影響

圖3 BLM誘導大鼠肺組織纖維化的病理學染色結果 (200 ×，n=3) 1. 肺泡間隔增寬；2. 纖維(藍色)；3. 肺泡結構破壞；4. 纖維(紅色)

薯蕷皂苷處理組(Dio 60、30和15 mg/kg)小鼠的以上癥狀得到明顯改善，肺組織的H&E，Masson和Sirius red染色(如圖4)所示?？诜硎氃碥蘸螅笫蠓谓M織中膠原明顯減少(P<0.05)，纖維化程度降低，肺泡結構有所恢復，且成劑量依賴性。60 mg/kg組的Masson染色的相對纖維量由Model組的9.53±1.41降低至3.29±0.28。60 mg/kg組的Sirius red染色的相對纖維量由Model組的5.81±0.78降低至1.44±0.26。以上結果表明薯蕷皂苷可以有效改善BLM誘導的肺組織病理學變化，減少纖維化的發生。

圖4 薯蕷皂苷對大鼠肺組織病理學染色(H&E、Masson和Sirius Red)的結果(200×)

三、 各組大鼠肺組織關鍵蛋白的表達

大鼠肺組織Western blot檢測結果(如圖5)所示，與BLM模型組相比，Dio15 mg/kg, 30 mg/kg和60 mg/kg給藥組中，TGF-β1，Foxo3a，ICAM-1，P65蛋白的表達顯著降低(P<0.05或P<0.01)，具有統計學意義。因此，薯蕷皂苷能明顯下調肺纖維化大鼠肺組織中炎癥反應。結果表明，薯蕷皂苷體內抑制肺纖維化的發生、發展與TGF-β1/Foxo3a信號通路相關。

圖5 薯蕷皂苷對肺纖維化大鼠肺組織中TGF-β1，Foxo3a，ICAM-1，P65蛋白的表達

討 論

IPF是一種進行性異質性肺病，患病后肺呼吸功能嚴重受損，治愈率較低，最終患者會因呼吸衰竭而死亡。臨床上用于治療該疾病的藥物包括尼達尼布、吡非尼酮、免疫抑制劑和皮質類固醇激素等西藥，還包括藏紅花、黃芪、丹參和五味子等中藥，但藥物的選擇仍有限，治療效果仍不理想。因此，探尋肺纖維化的有效治療藥物成為當下醫學研究的熱點和難點。BLM誘導的肺纖維化動物模型模擬了IPF的臨床病理特征，常被用于IPF治療藥物的藥效學和分子機制研究。在本研究中，我們建立了BLM誘導的大鼠肺纖維化模型來評價薯蕷皂苷的抗肺纖維化活性，而肺系數、T-AOC、HYP以及病理學染色結果均表明，薯蕷皂苷對BLM誘導的肺纖維化具有顯著的保護作用。

IPF的病理機制仍不明確，但其發生和發展與許多細胞因子、炎癥介質有關，這些細胞因子和炎癥介質之間相互作用，相互協調，形成一個復雜而多變的分子網絡，在肺纖維化形成中起著重要的作用[8]。TGF-β1在肺纖維化發病過程中，起著中樞調控的重要作用，是作用最強的致纖維化因子，而且參與調控發病機制非常明確，TGF-β1能誘導大量成纖維細胞增殖分化為肌成纖維細胞，而肌成纖維細胞對細胞凋亡有抵抗作用，并在成纖維細胞病灶的活動性纖維化部位聚集，最終導致細胞外基質(Extracellular matrix, ECM)的過多產生和沉積[9-11]。BLM可以誘導肺纖維化發生，導致TGF-β1升高，促進肺部炎癥反應，增加炎性細胞的數量，而薯蕷皂苷則可以顯著減少TGF-β1的表達，緩解肺部炎癥，抑制肺纖維化的發生。

近年研究表明，FOX (forkhead box protein)家族是調控上皮細胞間質轉分化的重要轉錄因子[12]，其中Foxo3a (forkheadbox protein O3a)是參與纖維化的發生發展的重要成員[13]。Foxo3a在TGF-β誘導的腎上腺皮質轉分化中具有重要作用，另有研究發現Foxo3a參與了肺纖維化上皮間質轉分化的過程，是特發性纖維化治療的重要靶點，參與體內凋亡、氧化應激等多種病理生理過程的調節[14-15]。本研究結果發現，BLM可以促進Foxo3a表達，而薯蕷皂苷可以顯著降低Foxo3a的表達。此外，Foxo3a可以激活NF-kB，調控多種炎癥因子的基因轉錄[16]。NF-κB在炎癥反應調控中起核心作用，P65是其重要的功能亞單位，NF-κB的過度活化，會導致細胞因子、趨化因子基因表達增高，導致肺纖維化[17-18]。P65表達的增加可以誘導ICAM-1[19]，ICAM-1在炎性細胞及肺泡上皮的表達增加，提示其參與肺纖維化的肺組織的炎癥與修復過程[20-22]。薯蕷皂苷可以減少BLM導致大鼠肺組織中的Foxo3a及其下游P65和ICAM-1的表達，即薯蕷皂苷通過調控炎癥反應抑制肺成纖維細胞向肌成纖維細胞的轉化以遏制纖維化發展。因此，我們認為薯蕷皂苷主要是通過抑制TGF-β1的表達進而調控Foxo3a的表達減輕肺纖維化上皮間質分化，調控炎癥反應而發揮對肺纖維化保護作用。

本文研究結果表明薯蕷皂苷可以顯著減輕BLM誘導的肺組織結構破壞及間質纖維化，對BLM誘導的大鼠肺纖維化具有顯著保護作用，該作用可能是通過調控TGF-β1/Foxo3a信號通路實現的。