溫陽活血湯治療骨轉移癌作用機制探討

楊夢霞，毛 昀，周 磊，朱世杰，王寧軍，蘆殿榮

(1.北京中醫藥大學，北京 100029 2.中國中醫科學院望京醫院，北京 100102)

骨轉移癌是乳腺、肺和前列腺癌等惡性腫瘤常見并發癥，可引起疼痛、脊髓壓迫、病理性骨折等一系列臨床表現，給晚期腫瘤患者的生存質量帶來了嚴重不良影響[1]。目前多采用手術、放療、雙膦酸鹽類藥物治療等延緩骨轉移，但總體療效欠佳，且不良反應明顯[2]。近年來中醫藥以其副作用少、療效佳等優勢在骨轉移癌治療中取得了較好的臨床效果，在臨床上受到了廣泛關注[3]。骨轉移癌屬于中醫學骨痹、骨蝕、骨瘤、脛陰疽等范疇，其病機多為正虛邪實。其中正虛多為腎虛、陽虛，邪實多為寒、痰、血瘀和癌毒等，故在治療上應重視扶正，并聯合溫陽活血、散寒化痰，攻毒抑癌等方法[4]。基于此，我院自擬溫陽活血湯治療陰寒凝滯型骨轉移癌，取得了較好的臨床療效，但尚未對其作用機制進行研究。近年來網絡藥理學因其融合了系統藥理、生物學及計算機信息學等內容的獨特優勢，發展迅速，可通過多層次相互作用的中藥、化合物、靶點、疾病基因和信號通路網絡示意圖的構建來探討中醫藥作用機理，是較為全新的一種方法。本研究擬運用網絡藥理學方法探討溫陽活血湯治療陰寒凝滯型骨轉移癌的分子機制，以期能夠在基礎研究中為后來學者提供新思路，在臨床上為醫生用藥提供一定參考價值。

1 資料與方法

1.1溫陽活血湯有效成分的篩選:在數據庫TCMSP中，以口服生物利用度OB、類藥性指數DL分別不小于30%和0.18為篩選條件，收集溫陽活血湯8味中藥化合物成分；此外，以TCMID、TCM Database@Taiwan為補充數據庫，并聯合文獻數據庫如知網、萬方等檢索溫陽活血湯相關成分。

1.2藥物有效成分作用靶點的預測:使用數據庫TCMSP查找主要有效成分相關靶蛋白,并結合Uniprot數據庫查詢其對應的Gene Symbol；在PubChem中獲取化合物有效成分的SMILES結構，并在數據庫Swiss Target Prediction中將上述獲得的結構輸入，且以“Homo sapiens”為篩選條件進行相關靶點的查詢，保留匹配度高的靶點，之后將兩個數據庫中獲得的靶點進行去重，并在MCODE插件中進行核心基因的篩選。

1.3骨轉移癌潛在治療靶點篩選:本研究將“Gene”和“Homo sapiens”設置為檢索條件，在疾病基因數據庫DisGeNet和Drugbank中尋找骨轉移癌相關基因,最后去重。

1.4溫陽活血湯治療骨轉移癌的主要潛在靶點:將藥物相關作用靶點和疾病基因在Venny2.1中進行映射，篩選出溫陽活血湯治療骨轉移癌的靶點有105個。之后在STRING11.0數據庫中，輸入上述靶點并將“Homo sapiens”作為選擇物種，可獲得PPI互作網絡，并在Cytoscape3.6.0中進行可視化。

1.5靶基因的功能分析:在DAVID數據庫中對溫陽活血湯治療骨轉移癌的潛在靶點做GO和KEGG富集分析，其中GO分析包含了生物過程BP、細胞成分CC和分子功能MF。

2 結 果

2.1溫陽活血湯主要活性成分:在數據庫TCMSP、TCMID和TCM Database@Taiwan中檢索到溫陽活血湯所有化學成分共計707個。以OB、DL分別不小于30%和0.18為篩選閾值，并結合文獻檢索，合計有效成分共109個，見表1。

表1 溫陽活血湯的主要有效成分

leonticineSexangularetin13-methylpalmatrubinebeta-sitosterolN-methyllaurotetaninesitosterolnorglaucing黨參(21個)poriferasta-7,22E-dien-3beta-olPontevedrinePerlolyrinePseudocoptisineDiop24240-05-9ZINC03978781saulatineStigmasterolstylopine7-Methoxy-2-methylisoflavoneTetrahydrocorysamineSpinasteroltetrahydroprotopapaverineChrysanthemaxanthinST057701FrutinoneA2,3,9,10-tetramethoxy-13-methyl-5,6-dihydroisoquinolino[2,1-b]isoquinolin-8-oneluteolinStigmasterolTaraxerolPalmatinestigmast-7-enolFumarine3-beta-HydroxymethyllenetanshiquinoneIsocorypalminemethylicosa-11,14-dienoatebicuculline5alpha-Stigmastan-3,6-dioneC093677-(beta-Xylosyl)cephalomannine_qtquercetinDaturilin山慈菇(3個)beta-sitosterolglyciteinStigmasterolSpinosideA2-methoxy-9,10-dihydrophenanthrene-4,5-diol(8S,9S,10R,13R,14S,17R)-17-[(E,2R,5S)-5-ethyl-6-methylhept-3-en-2-yl]-10,13-dimethyl-1,2,4,7,8,9,11,12,14,15,16,17-dodecahydrocyclo-penta[a]phenanthren-3-one補骨脂(3個)Daucosterol11-Hydroxyrankinidineisobavachin炙黃芪(1個)beta-sitosterolStigmasterol

2.2溫陽活血湯潛在治療靶點:在數據庫TCMSP和Swiss Target Prediction中檢索溫陽活血湯109個化合物的相關靶點，去重后保留高匹配度靶點，最終得到相關靶點374個。在數據庫STRING11.0中獲得374個相關靶點PPI網絡，并在Cytoscape3.6.0中對此網絡作可視化分析，發現此網絡中包含節點369個和邊數7623條。在MCODE插件中進行基因篩選，得到158個核心基因，位于A、B、C三個子簇，見圖1。三個子簇包含的節點數分別為66、59和33；組成邊數分別為1686、426和182。

圖1 溫陽活血湯潛在治療靶點核心基因

2.3溫陽活血湯治療骨轉移癌的主要潛在靶點:以“Bone metastasis”為檢索詞，在疾病基因數據庫DisGeNet和Drugbank中最終得到773個靶基因，與藥物374個相關靶點進行映射，見圖2；最后獲得105個溫陽活血湯治療骨轉移癌的靶點，見圖3A。節點連接度Degree數值越大，說明有越多條邊與該節點相連，即該靶點越重要。據此，篩選出Degree值位于前25的關鍵靶點，見圖3。

圖2 溫陽活血湯治療骨轉移癌的潛在治療靶點和骨轉移癌疾病靶點的韋恩圖

圖3 溫陽活血湯治療骨轉移癌的105個靶基因(A)及核心基因(B)

2.4溫陽活血湯治療骨轉移癌靶基因的GO功能分析:在數據庫DAVID中對105個潛在治療靶點進行GO功能富集分析，共得到143條結果，其中BP、CC和MF分別涉及88項、11項和44項。以錯誤發現率FDR<0.05為篩選條件，獲得100個條目，其中BP63項、CC5項、MF32項，將BP、MF的前10項和CC的前5項繪制成氣泡圖來進行富集分析，見圖4。在BP方面，包括脂多糖介導的信號通路、5-羥色胺受體信號通路和細胞對血管內皮生長因子刺激的反應等；在CC中，涉及樹突、內溶酶體腔、血小板α顆粒腔、受體復合物、蛋白質細胞外基質等；在MF方面，涉及G蛋白偶聯的5-羥色胺受體活性、絲氨酸型內肽酶活性、蛋白酪氨酸激酶活性和蛋白激酶活性等。

圖4 溫陽活血湯治療骨轉移癌靶基因的GO功能富集分析

2.5溫陽活血湯治療骨轉移癌靶基因KEGG通路分析:通過對105個潛在治療靶點做KEGG通路分析發現，與溫陽活血湯治療骨轉移癌作用機理相關的通路有92條，以FDR<0.05為富集篩選條件，得到84條符合該條件的通路，取排名前25的通路在氣泡圖中進行富集功能分析，見圖5。相關通路主要有HIF-1信號通路、TNF信號通路、VEGF信號通路、ErbB信號通路、Toll樣受體信號通路、Rap1信號通路等。

圖5 溫陽活血湯治療骨轉移癌靶基因的KEGG通路富集分析

3 討 論

現代醫學認為骨轉移癌發生機制與骨微環境和腫瘤細胞的相互作用有關，在轉移過程中，成骨細胞、破骨細胞兩者之間動態失衡所產生的環境，更加有利于腫瘤細胞的轉移[5]。中醫學認為罹患腫瘤的患者多處于邪正并存的狀態，故在治則上應當扶正與驅邪并重，以改善機體狀態[6]。自擬溫陽活血湯中以干姜9g、肉桂10g和補骨脂20g溫陽；以紅花10g和延胡索20g活血；以黨參30g、炙黃芪30g和山慈菇20g扶正以驅邪，全方八位中藥共奏溫陽活血之功，但其作用機制尚未明確。

通過篩選溫陽活血湯的主要有效成分并構建多層次相互作用的成分與靶點相互作用網絡示意圖，發現槲皮素、豆甾醇、木犀草素、β-谷甾醇、山奈酚、黃芩素和β-胡蘿卜素等為其核心化合物，且大多數能抑癌、抗炎和調節免疫系統。其中槲皮素作為關鍵化合物，一方面可以通過抑制RANK-L、RANK等蛋白以及IL-8，TNF-α等炎癥介質的表達，增加OPG的水平，進一步降低PAR2/TRPV1通路中的相關分子(如PAR2,TRPV1等)和TNF-α和IL-1β的水平，最終使破骨細胞活化受抑、骨破壞程度得以下降[7]。豆甾醇和β-谷甾醇均可抑制脂多糖誘導的巨噬細胞產生和分泌多種炎癥介質，如活性氧，一氧化氮和TNF-α，主要與NF-κB信號通路相關：其中TNF-α可通過對NF-κB激酶IKKβ的抑制功能來增加NF-κB，而NF-κB3抑制劑的泛素化可減少NF-κB[8]。木犀草素可通過抑制PCNA蛋白和MMP-9蛋白的表達及PI3K/AKT通路活化來阻礙宮頸癌HeLa細胞的增殖和遷移[9]。

通過Cytoscape3.6.0軟件構建溫陽活血湯治療骨轉移癌的蛋白互作網絡示意圖，發現VEGFA、AKT1、IL6、TP53、ALB、CXCL8、CASP3、TNF、EGFR、EGF和MAPK3等為其關鍵靶點。VEGFA具有調節血管生成和促進癌細胞增殖的作用，其通路受到HIF和JAK/STAT通路的調節，且VEGFA信號級聯與MAPK通路有關[10]。促骨因子IL-6和TNF-α都可以刺激成骨細胞產生RANKL，可與RANK即破骨細胞前體表面的受體結合，刺激下游信號分子，包括MAPK和PI3K/AKT，并可對破骨細胞前體向功能性破骨細胞的轉化起促進作用。CXCL8，也稱為IL-8，通過與CXCR-1和CXCR2作用起調節炎癥反應的作用。此外，有研究發現在肝癌組織中CXCL8上調，可增加ERK、p-ERK和凋亡抑制基因Survivin的表達，降低CASP3和BAX的表達，從而使癌細胞增殖和遷移能力增加[11]。

根據GO和KEGG富集分析結果可以發現，溫陽活血湯治療骨轉移癌的作用機制主要包含抑癌，調節骨微環境和腫瘤細胞等方面。當骨微環境缺氧時，HIF-1可啟動缺氧基因的轉錄，這些基因對血管生成、腫瘤細胞凋亡和生長因子/細胞因子活性至關重要。此外，HIF-1還可與生長因子/細胞因子(如VEGF,EGF等)相互作用，這些因子在癌細胞上的表達可進一步促進癌細胞的增殖和轉移[12]。有研究表明，在缺血性壞死骨組織中TNF-α表達顯著上調，可激活p38MAPK/NF-κB信號通路。而抑制p38mapk/NF-κB通路可減弱TNF-α誘導的自噬作用，并增強TNF-α誘導的成骨細胞凋亡[13]。此外，也有研究發現，長非編碼RNA的SPRY4內含子轉錄1可通過TNF信號通路促進肝細胞癌的進展和轉移[14]。Toll樣受體(TLR)可調節機體免疫功能和細胞代謝，其中TLR4是TLR家族中最具代表性的成員，包含兩條信號通路：一是MyD88依賴型通路，可通過催化TRAF6泛素化啟動NF-κB和MAPK表達,促進炎性細胞因子釋放；二是MyD88非依賴型通路，該通路可通過活化NF-κB以促進炎性因子釋放，也可激活干擾素誘導基因IP-10與調節活化正常T細胞表達與分泌的趨化因子[15]。

綜上所述，基于網絡藥理學研究方法，可發現溫陽活血湯有效化合物為槲皮素、豆甾醇、木犀草素等，可通過HIF-1、TNF、VEGF等信號通路調控VEGFA、IL6、TNF等靶點，進而發揮抑癌、抗骨轉移和調節免疫系統的作用，對臨床上治療骨轉移癌用藥具有一定參考意義，但仍需后期基礎實驗加以驗證。