MicroRNA-27b介導沉默同源盒蛋白HOXB8對人胃癌干細胞樣特性的調節作用

楊向超，田由京，陳 禺，李 合

(海南醫學院第一附屬醫院普通外科，海南 海口 570102)

胃癌(gastric cancer)是消化系統中常見的惡性腫瘤疾病，死亡率位于第三位[1]。近年來，盡管在分子靶向治療方面取得了重大的進展，但由于耐藥性和復發性的出現，使得胃癌患者的中位生存率仍然很低。實驗證據表明，腫瘤干細胞(Cancer Stem Cell,CSC)是臨床放射療法和化學療法不敏感的重要原因，也是腫瘤轉移和復發的關鍵因素[2]。胃癌干細胞在胃癌進程中起著至關重要的作用，消除胃癌干細胞將大大有助于胃癌的治療。MicroRNA(miRNA)是一類保守的非編碼小RNA，通過與靶mRNA的3'UTR結合來抑制基因表達，在腫瘤干細胞的特性如自我更新、侵襲和腫瘤發生中均發揮作用[3]，目前已成為癌癥診斷研究的重點內容，可能是臨床抗腫瘤治療的一項新策略。miR-27b是位于C9orf3基因第14個內含子，以往研究表明，miR-27b參與多種腫瘤發生發展的關鍵環節，包括細胞周期、分化、轉移及黏附等[4]。同源盒蛋白B8(Homeobox B8，HOXB8)屬于HOX基因家族成員，是胚胎發育過程中的特異性轉錄因子，可在不同部位和不同組織中表達，并與多種腫瘤(如結直腸癌、宮頸癌、肺癌、惡性膠質癌等)的發生、發展有密切的相關性[5,6]。本研究通過檢測胃癌組織中miR-27b與HOXB8表達，并通過脂質體介導方法在胃癌干細胞中過表達miR-27b，探究其對胃癌干樣細胞的生物學特性的影響，以期為尋找新的胃癌治療策略提供一定的理論依據。

1 材料與方法

1.1臨床資料：收集30例胃癌組織及距癌組織邊緣5 cm以上的癌旁正常組織，均為我院2018年6月至2020年6月胃癌手術切除標本，其中男性患者21例，女性患者9例，年齡28～71歲，平均(48.23±5.16)歲。所有患者術前均未接受化療、放療等輔助治療，臨床資料完整。所有病例標本由2位專業的病理科副主任醫師診斷，患者及家屬均簽署知情同意書，本研究獲得醫院倫理委員會批準。

1.2主要試劑與材料:人胃癌細胞株SGC-7901(中國科學院細胞庫)，B27、堿性成纖維細胞生長因子、表皮細胞生長因子、白血病抑制因子、DMEM/F1培養液(美國Hyclone)，Trizol試劑盒和Lipofectamine 3000試劑盒(美國 Invitrogen)，TaqMan?advanced miRNA cDNA Synthesis試劑盒和TaqMan advanced miRNA Assays試劑盒(Genecopoeia公司)，PrimeScriptTM1st Strand cDNA Synthesis 試劑盒和SYBR?Premix Ex TaqTM Ⅱ試劑盒(日本Takara)，雙熒光素酶報告基因檢測試劑盒(南京諾維贊)，CD44+磁珠分選試劑盒(美國Thermo Scientific)，免疫熒光染色試劑(南京凱基生物)，BCA蛋白檢測試劑盒、PVDF膜、結晶紫染液和ECL試劑液(上海碧云天)，CCK-8試劑盒和EdU染色試劑盒(杭州四季青)，兔抗人HOXB8(英國Abcam)，鼠抗人GAPDH和辣根過氧化物酶標記的山羊抗兔IgG(上海昊鑫生物)。miR-27b mimic與陰性對照、WT-HOXB8 3’-UTR質粒載體與MUT-HOXB8 3’-UTR質粒載體均交由上海吉瑪制藥技術有限公司設計合成。

1.3方 法

1.3.1實時熒光定量PCR:將收集的胃癌組織及癌旁正常組織在無菌超凈臺剪碎，加入液氮研磨勻漿，Trizol試劑抽提總RNA，紫外分光光度計檢測RNA純度、濃度。根據TaqMan?advanced miRNA cDNA Synthesis試劑盒進行反轉錄獲取miRNA的cDNA，利用TaqMan advanced miRNA Assays試劑盒檢測組織中miR-27b表達，以U6作為內參。擴增條件為：95℃，10 min，循環1次；95℃，15 s，60℃，60 s，循環40次；根據PrimeScriptTM1st Strand cDNA Synthesis試劑盒說明書進行反轉錄獲取HOXB8基因的cDNA，按照SYBR?Premix Ex TaqTM Ⅱ試劑盒檢測組織中HOXB8 mRNA表達，以β-actin作為內參。擴增條件為：95℃ 5 min，循環1次；95℃ 3 s、60℃ 30 s，循環14次，99℃ 10 min，循環1次。實驗重復3次，擴增結束后，根據2-ΔΔCt法計算miRNA與基因的相對表達量。使用的引物序列如下：miR-27b上游引物：5′-GGGGTTCACAGTGGCTAAG-3′；下游引物：5′-CAGTGCGTGTCGTGGAGT-3′；U6上游引物：5′-CTCGCTTCGGCAGCACA-3′，下游引物：5′-AACGCTTCAGAATTTGCGT-3′；HOXB8上游引物：5′-ACACAGCTCTTCCCTGGAT-3′；下游引物：5′-CTTCTCCAGCTAAAGGGTCT-3′；GAPDH上游引物：5′-GGATTTGGTGTCGTATTGGGC-3′，下游引物：5′-CGCTCCTGGAAGATGGTGAT-3′；均交由上海生工生物工程有限公司合成。

1.3.2雙熒光素酶報告基因技術:通過生物信息學工具TargetScan7.2軟件，預測miR-27b與HOXB8 3’-UTR結合的靶位點序列，設計并合成野生型(WT-HOXB8 3’-UTR)和突變型(MUT-HOXB8 3’-UTR)HOXB8的3’-UTR質粒載體。取對數生長期的胃癌細胞SGC-7901，調整密度以1×105個/孔接種于24孔板內，37℃、5%CO2恒溫箱培養，使用 Lipofactamine 3000分別將miR-27b mimic或陰性對照(miR-27b NC)聯合構建好的WT-HOXB8 3’-UTR質粒載體或MUT-HOXB8 3’-UTR質粒載體轉染到SGC-7901細胞，置于培養箱培養24 h 后，PBS沖洗細胞，加入裂解液裂解細胞，根據雙熒光素酶報告基因檢測試劑盒說明書進行操作，檢測各組細胞熒光素酶活性。

1.3.3胃癌干細胞的分離、培養與鑒定:取培養于37℃、5%CO2恒溫箱、對數生長期的SGC-7901細胞，加入0.25%胰蛋白酶消化，以2000r/min離心5min，棄上清，加入含20 mg/L B27、10 μg/L堿性成纖維細胞生長因子、10 μg/L表皮細胞生長因子和20 μg/L白血病抑制因子的DMEM/F1培養液，制備細胞懸液，置于培養箱內繼續培養，隔日半量換液，傳代培養。取80 μL的細胞懸液，加入20 μL CD44+免疫磁珠混勻，置于4℃避光孵化30 min，離心棄上清，加入 Buffer溶液洗滌細胞，再將細胞重懸，嚴格按照試劑盒說明書操作，通過流式細胞儀分選CD44+標記的細胞。取分選后的細胞，按免疫熒光染色試劑盒說明流程操作，驗證CD44+/EpCAM+雙抗陽性表達，通過倒置熒光顯微鏡觀察并拍攝圖片。

1.3.4細胞轉染:取生長狀態良好的胃癌干細胞，調整密度以2×104個/孔接種于96孔板內，37℃、5%CO2恒溫箱過夜培養。將細胞隨機分為空白對照組、miR-27b NC組、miR-27b mimic組，將Lipofectamine 3000脂質體分別與miR-27b mimic以及對應的陰性對照(miR-27b NC)轉染至胃癌干細胞，操作步驟按照試劑盒說明書進行，置于37℃、5%CO2恒溫箱轉染6 h，更換新鮮培養基，接著繼續培養48h，收集細胞用于后續實驗。為保證轉染效果，轉染每2d執行一次。

1.3.5Western Blot:收集轉染后的3組胃癌干細胞，加入PBS清洗，使用RIPA裂解緩沖液提取總蛋白，置于冰上裂解，BCA法測定蛋白質含量。制備10% SDS-PAGE凝膠，取等量各組蛋白樣品加樣，通過電泳分離蛋白質，并電轉至PVDF膜，用5%脫脂奶粉,室溫封閉2h，TBST洗膜，加入稀釋的兔抗人HOXB8(1∶500)一抗工作液，以鼠抗人GAPDH作為內參蛋白(1∶1000)，4℃孵育過夜。次日，棄一抗工作液，TBST洗膜后，加入對應的辣根過氧化物酶標記山羊抗兔(1∶5000)二抗工作液，室溫孵育1h，TBST洗膜，利用ECL發光液顯色3min，凝膠成像系統拍照，Image Pro-Plus系統分析各蛋白條帶的灰度值，計算目的蛋白的表達水平。

1.3.6CCK-8法:胃癌干細胞按照1.2.3方法轉染后，置于37℃、5%CO2恒溫箱內培養，分別于培養24、48、72 h，每孔細胞中加入10μL CCK-8試劑液，混合均勻，繼續放在恒溫箱培養2h，酶聯免疫檢測儀測定450nm處吸光度值。

1.3.7EdU染色:收集轉染后的3組胃癌干細胞，調整密度按1×105個/孔接種在24孔板內，置于37℃、5% CO2恒溫箱培養24h，再更換為終濃度10μmoL/L EdU的培養基培養，繼續培養2h，棄去培養基，PBS洗滌細胞，4%多聚甲醛室溫固定20min，棄固定液，甘氨酸孵育5min，PBS洗滌后，滴加0.5% Triton X-100透膜10min，PBS再次洗滌細胞，加入Apollo567熒光染料室溫避光染色30min，清洗細胞后，通過Hoechst33342反應液室溫避光孵育30min染核，PBS清洗細胞，封片，激光共聚焦顯微鏡觀察細胞染色情況，藍色熒光為細胞核，紅色熒光為EdU陽性細胞。

1.3.8細胞成球實驗:收集轉染后的3組胃癌干細胞，胰酶消化，離心，加入含生長因子的無血清培養基，吹打分散為單細胞懸浮液，調整細胞密度以1×103個/孔接種在96孔板內，置于37℃、CO2恒溫中培養，1周后，倒置顯微鏡下觀察細胞球形成情況，并測量球體直徑。

1.3.9細胞克隆形成實驗:收集轉染后的3組CRC-CSCs細胞，離心并吹打分散為單細胞懸浮液，調整細胞密度以1×103個接種到無菌培養皿，輕晃培養皿，使細胞分散均勻，置于37℃、CO2恒溫箱中培養，待培養14d后出現明顯細胞集落，PBS清洗后，4%多聚甲醛固定菌落，0.5%結晶紫染液染色15min，流水沖洗干凈，干燥，光學顯微鏡觀察并計數細胞克隆形成數目，將≥50個細胞聚集即為1個細胞菌落。

2 結 果

2.1胃癌組織及癌旁組織中miR-27b與HOXB8表達比較：miR-27b在胃癌組織中的相對表達量顯著低于癌旁組織(t=36.768,P<0.001)，而HOXB8在胃癌組織中的相對表達量顯著高于癌旁組織(t=41.649,P<0.001)，見圖1。

圖1 實時熒光定量PCR檢測胃癌組織及癌旁組織中miR-27b與HOXB8表達

2.2miR-27b與HOXB8靶向關系驗證：通過TargetScan7.2預測到miR-27b與HOXB8 3’-UTR在特定區域存在堿基互補現象，見圖2A。雙熒光素酶報告實驗結果分析發現，miR-27b mimic和WT-HOXB8 3’-UTR重組質粒共轉染組的相對熒光值較miR-27b NC和WT-HOXB8 3’-UTR重組質粒共轉染組顯著降低(t=23.165,P<0.001)，而miR-27b mimic和MUT-HOXB8 3’-UTR重組質粒共轉染組與miR-27b NC和MUT-HOXB8 3’-UTR重組質粒共轉染組的相對熒光值差異無統計學意義(t=0.569,P=0.278)，見圖2B。

圖2 miR-27b與HOXB8靶向關系驗證

2.3胃癌干細胞的鑒定：流式細胞術檢測分選前后胃癌干細胞比例，結果顯示出在分選前與分選后CD44+標記的細胞亞群比例分別為1.34%、95.90%，可見分選后CD44+標記的細胞亞群比例明顯增加(t=30.426,P<0.001)，參考相關文獻[7]，說明分選到高純度CD44+標記的胃癌干細胞，見圖3。

圖3 流式細胞術檢測分選前后CD44+標記的細胞亞群比例

通過免疫熒光染色觀察分選后細胞中CD44和EpCAM雙抗體的表達，可見CD44顯示綠色熒光，主要表達于細胞膜，EpCAM顯示紅色熒光，主要表達于細胞膜和細胞質，見圖4。

圖4 免疫熒光染色觀察細胞中CD44和EpCAM

2.4轉染后胃癌干細胞miR-27b與HOXB8表達檢測：實時熒光定量PCR檢測轉染后胃癌干細胞中miR-27b表達，3組細胞間差異具有統計學意義(F=44.602，P<0.001)。與空白對照組比較，miR-27b mimic組細胞內miR-27b表達顯著升高(P<0.01)，miR-27b NC組和空白對照組之間差異無統計學意義(P=0.375)，見圖5A。Western Blot檢測轉染后胃癌干細胞中HOXB8表達，3組細胞間差異具有統計學意義(F=32.771，P<0.001)。與空白對照組比較，miR-27b mimic組細胞內HOXB8蛋白表達顯著下降(P<0.01)，miR-27b NC組和空白對照組之間差異無統計學意義(P=0.413)，見圖5B。

圖5 轉染后胃癌干細胞miR-27b與HOXB8表達比較

2.5miR-27b對胃癌干細胞活性影響：CCK-8檢測各處理組胃癌干細胞的活性，在轉染24、48、72h后，3組細胞間差異具有統計學意義(F24h=14.782,P<0.001;F48h=17.253,P<0.001;F72h=26.033，P<0.001)。與空白對照組比較，miR-27b mimic組細胞活性在各個時間點均顯著下降(P均<0.05)，而在各時間點miR-27b NC組和空白對照組的差異均無統計學意義(P24h=0.321；P48h=0.513;P72h=0.428)，見圖6。

圖6 CCK-8檢測各處理組胃癌干細胞活性

EdU染色結果如圖7所示，可見空白對照組和miR-27b NC組有大量EdU標記的陽性細胞表達，而miR-27b mimic組中EdU標記的陽性細胞表達減少，3組細胞間EdU標記的陽性細胞數目差異具有統計學意義(F=37.581，P<0.001)。與空白對照組比較，差異具有統計學意義(P<0.01)，miR-27b NC組和空白對照組之間則無統計學差異(P=0.118)。

圖7 EdU染色檢測各處理組胃癌干細胞增殖(×100)

2.6miR-27b對胃癌干細胞干性維持的影響：細胞成球實驗結果如圖8所示，通過倒置顯微鏡可觀察到空白對照組胃癌干細胞有大量細胞成球，直徑達到(515.46±40.48)μm，miR-27b NC組細胞也有大量細胞成球，直徑為(542.82±43.41)μm，而miR-27b mimic組細胞成球個數較少，直徑為(263.67±21.55)μm，球體積明顯變小。

圖8 細胞成球實驗檢測各處理組胃癌干細胞成球能力(左：×50；右：×200)

細胞克隆形成實驗結果見圖9，3組細胞間克隆數目差異具有統計學意義(F=36.903，<0.001)。與空白對照組比較，miR-27b mimic組胃癌干細胞克隆形成數目顯著減少(P<0.01)，而miR-27b NC組較空白對照組的細胞克隆數目之間的差異無統計學意義(P=0.081)。

圖9 細胞克隆形成實驗檢測各處理組胃癌干細胞克隆形成能力

3 討 論

胃癌在全球范圍內具有較高的發生率和死亡率，然而導致胃癌發生與轉移的分子機制仍不完全清楚，存在于胃癌組織中的腫瘤干細胞具有很強的致瘤性，能夠產生更多促進腫瘤生長的胃癌細胞亞群，是腫瘤轉移和復發的關鍵因素，并且對化學治療藥物具有較強的抵抗力[2]。多項研究已表明，胃癌干細胞是負責啟動胃癌復發、轉移和腫瘤耐藥的關鍵機制[8]，這為胃癌的診治研究提供了新視角。

細胞表面標志物的表達檢測是鑒定腫瘤干細胞的重要方法，目前，胃癌干細胞鑒定的幾種表面標記物有CD133、CD44和醛脫氫酶1(ALDH1)。其中，CD44是具有多種生物學作用的跨膜糖蛋白，在腫瘤的侵襲和轉移中起核心作用，以往研究結果表明，CD44+胃癌細胞比CD44-胃癌細胞顯示出更強的成球能力和侵襲能力，CD44+胃癌細胞具有腫瘤干細胞特性，目前使用CD44+標記分選胃癌干細胞已在多項研究中運用[7,9]。同樣，在本研究中通過CD44+標記磁珠分選法分選胃癌干細胞后，再次通過CD44和EpCAM雙抗體進行鑒定，結果顯示CD44+標記的細胞亞群比例高達95.90%，說明成功分選出胃癌干細胞。

胃癌的發生和發展是一個復雜的過程，miRNA可通過轉錄后調節癌基因或抑癌基因的表達影響胃癌細胞的生物學功能，包括致瘤性、侵襲性以及耐藥性。miR-27b在多種癌癥類型中起著復雜的作用，例如：Zhang等人[10]研究發現miR-27b在非小細胞肺癌中表達水平降低，通過靶向Snail1抑制肺癌的生長和上皮間質轉化過程；Feng等[11]研究指出miR-27b在胃癌組織和胃癌細胞中表達水平均下調，且miR-27b在TNM分期較高、腫瘤組織較大的組織中表達更低。本研究結果同樣顯示，miR-27b在胃癌組織中表達降低，而在胃癌干細胞中轉染mimic以過表達miR-27b后發現，腫瘤干細胞活性與增殖受到明顯抑制，同時腫瘤干細胞的成球能力與克隆形成能力均下降，由此推測，miR-27b可能在胃癌進程中起著抑癌基因的作用。

HOX基因家族作為胚胎發育中的重要轉錄因子，在各種組織中差異表達。研究表明，該同源異形基因家族與多種癌癥及相關疾病的發生發展均相關聯。例如，HOXB8在結直腸癌組織中表達升高，而抑制HOXB8表達與結直腸癌細胞對化學療法的敏感性增加有關[12]；HOXB8在人骨肉瘤組織和細胞系中均高度表達，敲低HOXB8可以通過調節Wnt/β-catenin信號通路抑制骨肉瘤的腫瘤發生和轉移[13]；在宮頸癌細胞中HOXB8作為miR-32-5p的下游調控靶標，降低HOXB8表達可抑制HeLa細胞的增殖、克隆形成、侵襲和遷移能力[14]。目前已發現HOXB8通過誘導上皮間質轉化來調節胃癌細胞的轉移[15]，這一結果揭示沉默HOXB8可能與逆轉胃癌細胞的惡性表型有關。但HOXB8在胃癌干細胞中的生物學功能尚不清楚。本研究發現HOXB8是miR-27b的直接靶基因，miR-27b可負調控HOXB8的表達，這表明了miR-27b可能通過直接調節HOXB8影響了胃癌干細胞的生物學特性。

綜上所述，在胃癌組織中miR-27b低表達而HOXB8高表達，HOXB8是miR-27b的靶標基因，miR-27b通過調控HOXB8表達抑制胃癌干細胞活性與自我更新能力。本研究表明miR-27b可能為胃癌潛在的治療靶點，為今后該疾病的診治研究提供了新的切入點。