自噬在腎臟缺血再灌注損傷中的研究進展

徐潔，王麗媛，于洋，唐小鐵

(1.武漢科技大學醫學院，武漢 430080；2.武漢科技大學附屬普仁醫院腎內科，武漢 430080)

臨床上，急性腎損傷具有發病率高、病死率高的特點，給患者和社會帶來極大的經濟負擔，是全球性的嚴重的醫療保健問題[1]。流行病學研究表明，急性腎損傷是終末期腎臟病的主要危險因素，常發展為慢性腎臟病[2]。腎臟缺血再灌注損傷是指缺血的腎臟在完全或部分恢復血流灌注后出現損傷加重及腎功能惡化(即腎組織細胞缺血缺氧、腎小管細胞損傷)而引起的腎臟損傷[3]。腎臟缺血再灌注損傷常見于心血管手術、創傷、休克和腎移植的患者，是臨床上急性腎損傷最常見的病因[4]，其發生機制非常復雜，是引起腎衰竭和影響預后的重要原因，但目前尚缺乏有效的治療策略[5]。導致腎臟缺血再灌注損傷的機制主要包括能量代謝障礙、鈣超載、線粒體損傷、氧化應激反應、炎癥反應、細胞凋亡及自噬等[6]。自噬廣泛存在于真核生物內，在調節細胞生命活動中具有重要作用[7]。許多疾病的發生、發展均涉及自噬，如感染、腫瘤、代謝性疾病[8]。目前自噬是各領域的研究熱點，其中，腎小管上皮細胞的自噬是目前關注的焦點。在急性腎損傷的發生、發展過程中，自噬相關信號通路上的關鍵部位可能為急性腎損傷的治療提供新的策略[9]，但自噬在腎臟缺血再灌注損傷中的作用尚存在爭議，現就自噬在腎臟缺血再灌注損傷中的研究進展予以綜述。

1 自噬的基本概念和發生過程

1.1自噬的基本概念 1962年，Ashford和Porter[10]在研究人肝細胞時，在電子顯微鏡下觀察到了自噬；隨后Tsukada和Ohsumi[11]在研究酵母時發現了自噬相關的分子機制；1969年在藥物誘導的腎損傷小鼠近曲小管中首次發現了包含受損細胞器的自噬體[12]。隨著研究的深入，自噬在急性腎損傷中的研究取得重大進展。自噬通過參與受損細胞器以及蛋白質的清除和再循環實現胞質成分更新，以保持細胞內平衡，并參與細胞生長、生存的調節，是機體進化過程中保守的代謝機制，對組織細胞具有保護作用。自噬時溶酶體水解酶降解細胞內受損的大分子、蛋白質聚集物和功能失調的細胞器，降解后的成分被回收，用于合成細胞生命活動所需的蛋白質、細胞器和能量等[13-14]。在生理條件下，自噬的順利進行有助于維持細胞內外穩態，進而維持機體穩態[15]，在人體各項生命活動的順利進行中均發揮重要作用。膿毒血癥、腎急性缺血以及藥物和重金屬誘導的腎毒性是引起急性腎損傷的常見原因，為了應對這些壓力，自噬途徑被激活[16]。通常情況下發生的自噬對組織細胞具有保護作用，但過強的刺激導致自噬過度也可能加重組織細胞損傷，甚至引起細胞死亡，稱為Ⅱ型程序性細胞死亡[17]。

根據細胞內容物運輸至溶酶體的方式，哺乳動物內的自噬包括巨自噬、微自噬和伴侶介導的自噬。巨自噬就是通常所說的“自噬”，是主要且廣泛研究的降解或消除受損細胞器和蛋白質的自噬途徑，底物蛋白被雙層膜的結構包裹后形成自噬體，并運輸至溶酶體內進行消化水解[18]。微自噬及伴侶介導的自噬研究較少。

1.2自噬的發生過程 自噬的發生過程非常復雜，主要分為3個階段，即自噬體形成、自噬體與溶酶體融合以及自噬溶酶體降解。自噬體的形成涉及多個自噬相關蛋白(autophagy related protein，Atg)復合體的協同作用，主要包括UNC-51樣激酶(uncoordinated 51-like kinase，ULK)1/2復合體、Beclin-1/Ⅲ類磷脂酰肌醇-3激酶復合體、Atg12-Atg5-Atg16 L1復合體以及微管相關蛋白1輕鏈3Ⅱ(microtubule-associated protein 1 light chain 3Ⅱ，LC3Ⅱ)的修飾等。哺乳動物雷帕霉素靶蛋白(mammalian target of rapamycin，mTOR)及AMP活化蛋白激酶(AMP-activated protein kinase，AMPK)共同參與ULK1/ULK2復合體的調節，以激活自噬[19]；隨后，Beclin-1/Ⅲ類磷脂酰肌醇-3激酶復合物啟動細胞膜泡成核，同時結合Atg21和Atg24到膜上，形成自噬體的前體裝配結構[20]。隔膜的延伸、閉合、形成自噬體涉及2條泛素化途徑：Atg12-Atg10中間體形成后促進Atg12和Atg5轉移，形成共價連接的Atg12-Atg5與Atg16L1結合形成Atg12-Atg5-Atg16L1復合體[21]；隨后，Atg12-Atg5-Atg16L1復合體被招募至吞噬泡膜上，通過與磷脂酰乙醇胺共價結合生成脂化LC3[22]；LC3被Atg4分解為LC3Ⅰ后被E1樣酶Atg7激活，轉運至Atg3，與磷脂酰乙醇結合成為LC3-磷脂酰乙醇(即LC3Ⅱ)，LC3Ⅱ是自噬體外膜和內膜的重要組成部分，而Atg12-Atg5-Atg16L1復合體只存在于自噬體的外膜[23]。

成熟的自噬體和溶酶體結合形成的自噬溶酶體可將其內底物進行降解，自噬生物學功能的順利進行依賴上述過程的順利完成。正常情況下，細胞內可觀察到少量自噬體，自噬活性提高，觀察到的自噬體增多；另外，自噬體與溶酶體結合障礙或者自噬溶酶體降解障礙引起自噬體無法清除，檢測到的自噬水平也可增高[24]。

2 自噬在腎缺血再灌注損傷中的雙重作用

自噬在腎缺血再灌注損傷的發生、發展過程中起重要作用，許多體內外實驗中均觀察到在腎缺血再灌注損傷過程中自噬被激活[25-26]，但表達上調的自噬究竟對腎臟起保護作用還是加劇腎臟損傷目前仍存在爭議。一方面，自噬可降解異常細胞內異常的蛋白及細胞器，防止有害物質的積累，對細胞的生存起到保護作用；另一方面，過高水平的自噬可損傷細胞器，使其轉化為自噬細胞死亡。因此，自噬在腎缺血再灌注損傷中是把雙刃劍。

2.1自噬對腎缺血再灌注損傷的保護作用 目前已有超過40種自噬相關基因被發現，為驗證自噬在腎缺血再灌注損傷中的作用，特異性剔除自噬相關基因Atg5后，電鏡下觀察發現，腎小管上皮細胞內存在大量損傷的線粒體、自噬底物p62等，腎臟對缺血性損傷更敏感，腎功能損傷更嚴重[27]。另外，在自噬相關基因Atg7剔除的小鼠體內也出現了相似的結果[28]，這些實驗均證實自噬缺乏可加重腎缺血再灌注損傷后的腎功能惡化。Bian等[29]的研究也表明，腎缺血后自噬不足可加重缺血再灌注損傷。在腎移植誘導的大鼠腎缺血再灌注損傷模型中，高壓氧治療可通過激活自噬減輕炎癥損傷，從而發揮保護作用[30]。而在缺血預處理模型中，通過血清和糖皮質激素誘導激酶1/叉頭框蛋白O亞族3a/缺氧誘導因子-1α通路可激活自噬流，發揮腎臟保護作用[31]。這些研究均提示腎缺血再灌注損傷誘導的自噬可能在疾病發生、發展過程中起到腎保護作用。但自噬保護腎缺血再灌注損傷的關鍵調控通路目前尚不清楚。腎缺血再灌注損傷是引起急性腎損傷的主要原因，自噬的激活可為腎組織細胞的存活提供保護機制，并為急性腎損傷的臨床治療提供潛在策略，但關鍵通路還有待進一步研究。

2.2自噬對腎缺血再灌注損傷的損傷作用 自噬的發生可能加重腎臟損傷，自噬通量異?；蜃允砷L時間激活可能會破壞細胞內穩態，引起細胞死亡[32-33]。Suzuki等[34]的研究提示，自噬在腎缺血再灌注損傷中可以加重腎組織損傷，而抑制自噬可顯著減少過氧化氫刺激的腎小管上皮細胞乳酸脫氫酶的產生，發揮腎臟保護作用。大鼠腎缺血再灌注損傷誘導的自噬被抑制后，腎組織細胞色素C和氧自由基的釋放顯著減少，腎功能顯著改善[35]。成纖維細胞生長因子10可通過mTOR途徑抑制過度自噬，并抑制由泛素結合蛋白核自噬受體SQSTM1(sequestosome 1)/p62介導的炎癥反應，減輕腎缺血再灌注損傷[36]。由此推測，自噬可能在缺血再灌注過程中對腎小管造成損傷。腎缺血再灌注損傷是動態變化的過程，自噬也隨之變化，造成上述研究差異的原因部分可能與實驗模型中采用的動物、細胞種類不同以及不同研究中缺血再灌注持續時間、觀察時間點各不相同有關[37]。因此，未來對腎缺血再灌注損傷中自噬作用及機制的研究應基于對這個變化過程的全面了解，這樣有助于更好地理解自噬在腎缺血再灌注損傷中的作用。

3 自噬在腎缺血再灌注損傷中可能的調控機制

3.1AMPK-mTOR通路 AMPK和mTOR是兩種營養能量敏感激酶，AMPK受AMP/ATP比值、缺氧、氧化應激等因素調控[38]。在腎缺血再灌注損傷中，AMPK-mTOR表達活躍，mTOR可以抑制自噬的發生，是自噬的負性調控因子，在自噬過程中發揮核心作用，而AMPK可以通過抑制mTOR來增強自噬[39]。在腎缺血再灌注損傷中，AMPK可間接通過抑制mTOR復合物1(mammalian target of rapamycin complex 1，mTORC1)的活性增強自噬或者直接通過磷酸化及活化ULK1/2調節自噬[40]。在體外缺血再灌注腎小管細胞損傷模型中，AMPK誘導的自噬對腎臟具有保護作用[41]。同樣，在腎小管細胞構建的缺氧/復氧模型中，用吡格列酮預處理可通過AMPK-mTOR信號通路增強自噬作用，從而保護機體免受缺血再灌注損傷[42]。肝再生增強因子也可通過AMPK/mTOR途徑負向調節腎缺血再灌注損傷中的自噬，自噬抑制細胞凋亡，并在氧化應激條件下發揮腎臟保護作用[43]。因此，AMPK調節的mTOR途徑是腎缺血再灌注損傷過程中誘導自噬的一個重要信號通路。

3.2磷脂酰肌醇-3-激酶(phosphatidylinositol 3-kinase，PI3K)-蛋白激酶B(protein kinase B，PKB/Akt)-mTOR通路 PI3K-Akt-mTOR通路可調控細胞周期、細胞增殖、細胞生長、存活、蛋白質合成以及葡萄糖代謝等[44]。mTOR蛋白在PI3K-Akt信號通路的下游，調控PI3K-Akt可通過mTOR影響自噬的發生、發展。在腎臟近端腎小管HK-2細胞中，蛋白酶激活受體2的過表達可通過激活PI3K-Akt-mTOR信號通路抑制自噬，并誘導自噬相關炎癥反應；同時，通過蛋白酶激活受體2的RNA干擾轉染剔除蛋白酶激活受體2可抑制PI3K-Akt-mTOR通路，極大地增加自噬并減輕自噬相關炎癥反應[45]。研究證實，雷帕霉素及其衍生物可通過抑制PI3K-Akt-mTOR通路激活自噬[46]。但研究中所涉及的自噬激動劑和抑制劑大多為非特異性，具體對哪一種自噬起作用目前尚不清楚，且這些藥物在增強或減弱自噬過程中可能對其他生理過程造成影響。最近的研究認為，mTOR抑制劑雷帕霉素不能預防腎缺血再灌注損傷或順鉑誘導的腎毒性引起的急性腎損傷，因此不可作為自噬相關腎保護機制的理想模擬物[47]。未來需尋找更具特異性的自噬激動劑和抑制劑進行進一步的研究。

3.3氧化應激相關作用機制 正常情況下，生物體維持低水平的氧化應激，而病理狀態下氧化還原穩態的失調及中性粒細胞的募集致活性氧類(reactive oxygen species，ROS)和活性氮過度生成，進一步導致氧化應激及相關細胞成分的氧化損傷，而代謝率高的腎近端小管細胞遭受了最嚴重的氧化應激損傷，導致細胞損傷和凋亡(即引起繼發性損傷)，在腎缺血再灌注損傷中抑制氧化應激反應可減輕腎臟損傷[48]。在腎臟疾病的發病機制中，氧化應激與自噬流的激活相關，mTOR是自噬通路的關鍵信號分子，其活性受PI3K、Akt、AMPK等多條通路調節，當ROS過度產生時，自噬可通過PI3K-Akt-mTOR通路啟動[49]；同時，ROS所誘導的自噬也受到AMPK/mTOR通路的調控[50]。研究證實，ROS還可通過影響AMPK-mTORC1-ULK1通路以及Kelch樣ECH相關蛋白1/核因子E2相關因子2系統調節自噬[51]。沉默信息調節因子1參與細胞存活、新陳代謝、基因沉默等多種過程，在體內腎缺血再灌注損傷模型中發現，沉默信息調節因子1可通過上調自噬抑制氧化應激，從而降低細胞凋亡，發揮腎臟保護作用[52]。另外，針對氧化應激產生的活性氮與自噬相關的研究較少，有研究表明，活性氮調節的自噬可能加重缺血再灌注損傷[53]?？赡苁怯捎跈C體在遭受缺血再灌注損傷時產生過量的ROS，引起脂質的氧化反應，使細胞內線粒體膜、內質網膜等受到損傷，而引發自噬增強，自噬通過降解受損細胞器及胞內異常的蛋白質等代謝產物維持細胞穩態，調控氧化應激、減輕腎臟損傷，發揮保護作用。

3.4p53途徑 腫瘤抑制基因p53在調節細胞凋亡和自噬中發揮重要作用，生理狀態下，p53作為四聚體發揮作用，并且低表達于細胞中，當各種原因使機體處于應激狀態時，p53轉錄活性升高，表達顯著升高，p53根據其亞細胞定位，對自噬的調控具有雙重作用，核p53可激活自噬，而胞質p53可能具有抗自噬功能[54]。研究證實，p53凋亡刺激蛋白2(apoptosis-stimulating protein two of p53，ASPP2)的下調可以通過激活自噬，改善腎缺血再灌注損傷誘導的急性腎損傷[55]。p53的轉錄活性還通過下調人第10號染色體缺失的磷酸酶及張力蛋白同源基因誘導激酶1(phosphatase and tensin homologue deleted on chromosome ten gene-induced kinase 1，PINK1)的轉錄而抑制自噬，而PINK1編碼參與線粒體吞噬的關鍵蛋白[56]。另外，胞質p53對細胞自噬的抑制作用還可能受到微RNA(microRNA，miRNA/miR)的調控，如miR-125b、miR-214等[57]。由于p53涉及體內多條代謝途徑，p53對自噬的作用目前仍存在爭議，還有待進一步研究。

3.5miRNA相關途徑 miRNA是由19～22個核苷酸組成的非編碼單鏈RNA，由于其在血液、尿液及其他體液中的穩定性，成為各種疾病的新型生物標志物，也是腎缺血再灌注損傷的研究熱點之一。在腎缺血再灌注損傷大鼠模型中發現，腎缺血再灌注損傷后血漿中的miR-192水平增加4倍，腎臟中的miR-192水平降低約40%，腎臟中miR-192表達在再灌注后7 d保持在低水平[58]。而小鼠模型中，尿miR-10a和miR-30d濃度與急性腎損傷的嚴重程度呈正相關[59]。這些研究表明，miRNA與腎缺血再灌注損傷密切相關。另外，在體內及體外腎缺血再灌注損傷研究中均發現miRNA參與了自噬的調控[9]。Liu等[60]在通過缺血再灌注建立的急性腎損傷小鼠體內模型中發現，小鼠腎缺血再灌注損傷后，miR-34a表達上調，且miR-34a可以直接與Atg4B的3′非翻譯區結合，通過Atg4B靶向調節自噬活性，從而加重腎缺血再灌注損傷。同時，研究還發現，在腎缺血再灌注損傷期間，miR-21水平升高，且miR-21抑制劑預處理可增強LC3Ⅱ和Beclin-1的表達，減輕腎損傷，而miR-21是通過Rab11a靶向抑制腎缺血再灌注損傷中的自噬的[61]。而體外缺氧條件下，在腎臟近端腎小管HK-2細胞中檢測到LC3Ⅱ和Atg16L1表達增加、miR-20a-5p表達降低，并發現miR-20a-5p通過Atg16L1靶向介導缺氧誘導的自噬[62]。由此可見，miRNA可以作為信號分子參與腎缺血再灌注損傷的病理生理過程，未來miRNA可能成為急性腎損傷潛在的治療靶點。

4 小 結

自噬與腎臟缺血再灌注損傷密切相關，闡明腎臟缺血再灌注損傷與自噬相互作用的分子機制以及在自噬途徑中的特定靶點，有助于為預防及治療腎臟缺血再灌注損傷的藥物研發尋找新的靶點。但目前仍有許多問題亟待解決，如自噬在腎臟缺血再灌注損傷中的研究多局限于細胞及動物模型，目前的研究結果在人的腎臟中是否可以得到相似的結論尚缺乏臨床實踐。研究者傾向于自噬在急性腎損傷中具有保護作用，但不能簡單地理解為提高自噬就有利于急性腎損傷，其作用機制涉及多條信號通路及作用途徑。另外，自噬在腎臟缺血再灌注損傷中的研究成果如何向臨床轉化還需要研究者們繼續探索。