HPLC法測定金酸萍顆粒中蒽醌類成分的含量

杜繼權 吳春玲 張志君

湖北科技學院藥學院，湖北 咸寧 437100

中成藥金酸萍顆粒由北劉寄奴(SiphonostegiachinensisBenth.)、酸模(RumexacetosaL.)、萍(Marsilea quadrifolia L.)3味藥組成，具有清熱解毒、利濕退黃的功效[1]，主要用于治療急性黃疸型、慢性、重癥等類型肝炎，有降低轉氨酶、恢復肝功能的作用[2-4]。方中臣藥酸模，系蓼科酸模屬植物，在我國廣泛分布，民間作“土大黃”使用，根主要含有大黃素型蒽醌類化合物，具有清熱解毒、涼血止血之功[5-7]。

金酸萍顆粒標準WS3-B-1561-93收載于部頒標準(中藥成方制劑第八冊)，原標準只對性狀、酸模的薄層鑒別和通則進行檢測[8]，而無含量測定項，不能全面反映酸模質量。因此，金酸萍顆粒中3個蒽醌類成分的定量測定方法的建立，為金酸萍顆粒的質量標準修訂與提高提供依據，更好的控制金酸萍顆粒的質量。

1 儀器與試藥

1.1 儀器 北京清博華LC300型高效液相色譜儀，UV檢測器；Hypersill GOLD C18柱(4.6 mm×250 mm，5 μm)；超聲波清洗器(上海船舶電子設備研究所 )；GWP十萬分之一分析天平(型號：XS105DU)。

1.2 試藥 大黃素對照品(批號：110756-201512)、大黃酚對照品(批號：110757-201607)和大黃素甲醚對照品(批號：110758-201817)均購自中國食品藥品檢定研究院；金酸萍顆粒(批號：20190204，20200707，20200901，20201001，20201002，20201003，20201004，20201005，20201101，20201102，20201103)和缺酸模的陰性樣品均由湖北福人金身藥業有限公司提供；甲醇為色譜級(天津歐博凱化工有限公司)；實驗用水為CM-RO-C2型超純水機制水，其它試劑為分析純。

2 方法與結果

2.1 色譜條件 色譜柱: Hypersill GOLD C18柱(4.6 mm×250 mm，5 μm)；流動相為甲醇(A):0.1%磷酸水溶液(B)=85∶15；流速為:1.0 mL/min；UV：254 nm；柱溫控制在25 ℃；進樣體積20 μL。所檢測成分理論塔板數不低于5000。

2.2 溶液的制備 對照品溶液：分別精密稱得適量上述對照品于量瓶，加甲醇溶解并定容，得對照品貯備液，4 ℃避光保存。精密移取1.25 mL貯備液于 10 mL 棕色量瓶，定容得濃度為大黃素20 μg/mL、大黃酚9 μg/mL以及大黃素甲醚16 μg/mL的對照品溶液。

供試品溶液：精準稱取金酸萍顆粒粉末1 g到具塞錐形瓶中，加25 mL甲醇，超聲提取30 min，放冷后用甲醇補重，取5 mL續濾液水浴蒸干，然后依次加入水10 mL、濃鹽酸2 mL及二氯甲烷10 mL，熱回流水解30 min，待冷確后倒到60 mL分液漏斗中，用少量二氯甲烷洗滌2次，并入分液漏斗中，靜置后分取二氯甲烷層，酸液再以二氯甲烷萃取，共2次，每次10 mL，合并并回收二氯甲烷，殘渣加適量甲醇溶解，轉到10 mL量瓶定容，即得[10-12]。

陰性樣品溶液：取陰性樣品，其制備操作與供試品處理方法相同，即得。

2.3 專屬性試驗 取“2.2”項下制備的三種溶液，照“2.1”項下條件采集色譜圖，結果見圖1。由圖1可知，在既定色譜條件下， A和B中3個色譜峰的保留時間均能相對應，而C在相應的時間未出峰，說明專屬性較強。

2.4 線性關系考察 取6個10 mL棕色量瓶，移液槍依次準確加入0.3125 mL、0.625 mL、1.25 mL、2.5 mL、3.75 mL、5 mL對照品貯備液，用甲醇稀釋至刻度線，得到6個不同濃度的對照品溶液。在“2.1”項色譜條件下，濃度從低到高依次測定，并對其數據處理。峰面積為Y軸，濃度(μg/mL)為X軸，得到3個成分的標準曲線：大黃素y=82.6569x+36.4847，r=1.0000；大黃酚y=142.3478x+18.1365，r=1.0000；大黃素甲醚y=22.9311x+11.4092，r=0.9999。3個成分依次在5～80 μg/mL， 2.25～36 μg/mL和4～64 μg/mL與峰響應值相關性良好。

注：1.大黃素；2.大黃酚；3.大黃素甲醚圖1 對照品(A)、供試品(B)及陰性樣品 (C)的HPLC色譜圖

2.5 儀器精密度試驗 精密吸取20 μL對照品溶液，依“2.1”色譜條件，重復進樣6次測定3個成分的峰面積，并計算得大黃素、大黃酚、大黃素甲醚峰面積的RSD分別為0.93%、1.13%和0.61%，說明該儀器精密度較好。

2.6 重復性試驗 按“2.2”項制備6份供試品溶液(批號：20190204)，照“2.1”項色譜條件，采集峰面積，計算得大黃素、大黃酚、大黃素甲醚含量的RSD分別為1.29%、1.96%、0.88%，表明該法重復性良好。

2.7 穩定性試驗 取同一供試品溶液(樣品批號：20190204)，以“2.1”項色譜條件下，在0～24 h每隔一段時間測定大黃素、大黃酚、大黃素甲醚的峰面積，并計算峰面積的RSD(n=6)分別為0.71%、0.83%、1.14%，表明在24 h內供試品溶液比較穩定。

2.8 加樣回收率試驗 取知道含量的樣品(批號：20190204)約1 g，精密稱定，以1∶0.5，1∶1，1∶1.5的比例精準加入對照品，再按“2.2”項下方法制備，每個比例平行3份，照“2.1”色譜條件測定峰面積，計算回收率及RSD。大黃素、大黃酚、大黃素甲醚的平均加樣回收率分別為96.12%、104.22%和97.41%，RSD分別為2.47%、1.57%和1.96%。結果見表1。

表1 加樣回收率試驗結果 (n=9)

2.9 樣品含量測定 取11批次樣品，依法制備樣品并測定其峰面積，以標準曲線計算樣品3個成分的含量(按干燥品計)，結果見表2。

表2 樣品含量測定結果 (mg·g-1,n=2)

3 討論

3.1 樣品提取條件的優化 在制備供試品溶液時，摸索了不同提取方式(超聲和加熱回流方式分別提取30 min和45 min)、提取溶劑(甲醇、80%甲醇、乙醇、80%乙醇)、溶劑用量(12.5 mL、25 mL、50 mL)、鹽酸用量(1 mL、2 mL、3 mL)和水解時間(30 min、45 min、60 min)對待測組分含量的影響。結果顯示以加入25 mL甲醇，超聲30min，加入鹽酸2 mL，水解30min的提取條件較佳。

3.2 色譜條件的優化 供試品和對照品溶液的全波長掃描結果顯示，兩溶液最大吸收波長均在 254 nm 和285 nm附近，同時參考2015版中國藥典大黃中蒽醌類成分的含量測定方法[13]，檢測波長確定為254 nm。曾對甲醇-0.1%磷酸溶液的比例進行考察，發現以體積比為85∶15時3種成分的保留時間適中，理論塔板數較高，峰形良好，可滿足快速定量檢驗的要求。

3.3 樣品測定結果分析 表2含量測定結果顯示，樣品中大黃素、大黃酚和大黃素甲醚的含量分別為1.2468～1.6092 mg/g、0.3259～0.5183 mg/g、0.8122～1.2486 mg/g，該廠提供的不同批次樣品3個蒽醌成分的含量水平波動較大，推測原因可能與原料藥的質量差異有關，因此應當嚴格控制原料藥的質量，把控生產環節，以保證藥品質量的穩定。

4 結論

本研究建立了金酸萍顆粒中3個大黃素型蒽醌類成分的HPLC含量測定方法，該方法操作簡單，專屬性強，快速準確，可為金酸萍顆粒的質量控制提供參考依據。