HPLC法測(cè)定少腹逐瘀丸中阿魏酸含量

黃云先 劉云懷

云南省麗江市食品藥品檢驗(yàn)所，云南 麗江 674100

少腹逐瘀丸由當(dāng)歸、蒲黃、五靈脂、赤芍、小茴香(鹽炒)、延胡索(醋制)、沒藥(炒)、川芎、肉桂、炮姜10味藥組成，具有溫經(jīng)活血、散寒止痛的功效。用于寒凝血瘀所致的月經(jīng)后期、痛經(jīng)、產(chǎn)后腹痛，癥見月經(jīng)后錯(cuò)、行經(jīng)小腹冷痛、經(jīng)血紫暗、有血塊、產(chǎn)后小腹疼痛喜熱、拒按。本品收載于《中國(guó)藥典》2020年版一部中，標(biāo)準(zhǔn)中僅有顯微鑒別及芍藥苷的薄層色譜鑒別，沒有制定含量測(cè)定方法，不能有效地控制藥品質(zhì)量。筆者采用HPLC法測(cè)定當(dāng)歸中阿魏酸的含量質(zhì)控方法，結(jié)果令人滿意，現(xiàn)報(bào)道如下。

1 儀器與材料

1.1 儀器 安捷倫1260型高效液相色譜儀(二極管陣列檢測(cè)器)；HPLC Column Hubble C18柱(250 mm×4.6 mm，OmniGene LLC)；德國(guó)塞多利斯BT224S電子分析天平；梅特勒MS205DU電子分析天平；Purelab Flex 超純水機(jī)。

1.2 材料 阿魏酸(C10H10O4)對(duì)照品適量(批號(hào)：110773-201614，中國(guó)食品藥品檢定研究院)；少腹逐瘀丸(批號(hào)：191208，200708，201007，191114，國(guó)內(nèi)某藥廠)乙腈、甲醇(色譜純，美國(guó)塞默飛世爾科技(中國(guó))有限公司)； 磷酸(分析純，天津市風(fēng)船化學(xué)試劑科技有限公司)；水(實(shí)驗(yàn)室自制UP水，Ω=18.3)。

2 方法與結(jié)果

2.1 色譜柱與系統(tǒng)適用性試驗(yàn) 色譜柱：Hubble C18柱(250 mm×4.6 mm，5 μm)；以乙腈-0.085%磷酸溶液(17∶83)為流動(dòng)相；檢測(cè)波長(zhǎng)為 316 nm；柱溫35 ℃。流速為1.0 mL/min，進(jìn)樣量 10 μL。色譜圖如圖1所示。

2.2 溶液的制備

2.2.1 對(duì)照品溶液 阿魏酸(C10H10O4)對(duì)照品適量，加70%甲醇稀釋至刻度，制成每1 mL含43.84 μg的溶液，作為對(duì)照品液，即得。

2.2.2 樣品溶液的制備 取少腹逐瘀丸約2 g，精密稱定，置具塞錐形瓶中，加入70%甲醇20 mL，稱定重量。超聲處理30 min，放冷，再次稱定重量，用70%甲醇補(bǔ)足減失重量。濾過，濾液作為樣品溶液。

2.2.3 陰性樣品溶液的制備 按本品的已知處方制備缺少當(dāng)歸的模擬樣品，按供試品溶液的制備方法制備陰性樣品溶液。

2.3 專屬性試驗(yàn) 將阿魏酸對(duì)照品溶液、樣品品溶液和陰性樣品溶液分別注入液相色譜儀，進(jìn)行測(cè)定。結(jié)果樣品溶液中均檢測(cè)出待測(cè)成分，而陰性樣品溶液無干擾。

2.4 線性關(guān)系 取阿魏酸(C10H10O4)對(duì)照品 10.96 mg，精密稱定，加甲醇制成每1 mL含21.92、43.84、87.68、131.52、175.36、219.2 μg 的一系列的對(duì)照品溶液。分別精密吸取上述對(duì)照品溶液10 μL，注入液相色譜儀，在上述色譜條件下測(cè)定其峰面積，以對(duì)照品的濃度(μg/mL)為橫坐標(biāo)，峰面積為縱坐標(biāo)，按外標(biāo)法進(jìn)行線性回歸，線性方程為y=42.65537x-149.68159，r=0.99969。說明阿魏酸在21.92～219.2 μg/mL 濃度范圍內(nèi)線性良好。

2.5 精密度試驗(yàn) 取43.84 μg/mL阿魏酸對(duì)照品溶液10 μL，在上述色譜條件下，重復(fù)進(jìn)樣6次，測(cè)定其峰面積：1122.16、1124.88、1131.24、1148.32、1150.41、1133.70。計(jì)算秋阿魏酸峰面積RSD=1.04%(n=6)，表明該系統(tǒng)的精密度良好。

2.6 重復(fù)性試驗(yàn) 取批號(hào)200708的少腹逐瘀丸樣品6份，按“2.2.2”方法制備供試品溶液，進(jìn)樣量10 μL，照上述色譜條件進(jìn)行測(cè)定，測(cè)得阿魏酸峰面積RSD=1.1%。表明方法重復(fù)性較好。

A

B

C

2.7 穩(wěn)定性試驗(yàn) 取同一份少腹逐瘀丸供試品溶液，按含量測(cè)定方法分別在配制0、2、4、8、16、24 h后進(jìn)樣，測(cè)得峰面積RSD=0.8%。表明供試品溶液在 24 h 內(nèi)穩(wěn)定。

2.8 回收率試驗(yàn) 取批號(hào)200708的少腹逐瘀丸樣品9份，每份約2 g，精密稱定，置錐形瓶中，分別精密加入阿魏酸對(duì)照品43.84、87.68、131.52 μg/mL 3種水平，各3份按“2.2.2”方法制備供試品溶液，照上述色譜條件測(cè)定，計(jì)算少腹逐瘀丸中阿魏酸的回收率分別為97.7%、99.8%、102.3%、98.4%、99.7%、101.5%、99.6%、102.9%、99.6%；RSD=1.74%(n=9)。

2.9 樣品含量測(cè)定 取少腹逐瘀丸四批，一式兩份，按“2.2.2”方法制備的樣品溶液，分別進(jìn)樣15 uL進(jìn)行測(cè)定，按外標(biāo)法計(jì)算少腹逐瘀丸中阿魏酸(C10H10O4)的含量。結(jié)果見表1及圖2所示。

表1 四批少腹逐瘀丸的含量測(cè)定結(jié)果 (μg/mL，n=2)

3 討論

在阿魏酸研究中，根據(jù)阿魏酸的理化性質(zhì)和有關(guān)參考文獻(xiàn)，分別用了水；30%、50%、70%甲醇和乙醇；純甲醇和純乙醇為提取溶媒，其他處理方法不變，經(jīng)實(shí)驗(yàn)70%乙醇提取效率高。

因少腹逐瘀丸為復(fù)方制劑，成分復(fù)雜，為了獲得阿魏酸滿意的分離度，篩選了乙腈-0.085%磷酸溶液(17∶83)(18∶82)(20∶80)、乙腈-0.1%磷酸溶液(17∶83)(18∶82)(20∶80)6組流動(dòng)相進(jìn)行考察，結(jié)果乙腈-0.085%磷酸溶液(17∶83)分離效果好，峰形良好，且保留時(shí)間適中，故確定上述流動(dòng)相系統(tǒng)為本法的流動(dòng)相。

當(dāng)歸為少腹逐瘀丸中重要組成，其中含阿魏酸等活性成分，測(cè)定其含量對(duì)控制制劑質(zhì)量有意義。從線性、可行性、穩(wěn)定性、重復(fù)性、回收率等實(shí)驗(yàn)考察，用HPLC測(cè)定少腹逐瘀丸復(fù)方制劑中的含量，方法簡(jiǎn)便可靠、分離度好，結(jié)果穩(wěn)定。

在實(shí)驗(yàn)過程中筆者對(duì)赤芍中的芍藥苷進(jìn)行了探索性研究，因少腹逐瘀丸成分復(fù)雜，干擾因素多，暫未摸索出有效提取方法，導(dǎo)致峰分離效果不好，峰面積較小，有待進(jìn)一步深入探索研究。