人參皂苷Rbl對小鼠皮膚光老化氧化應激的改善作用

王倩， 萬品文， 曹麗楠， 李雪莉

（1.南陽市中心醫院皮膚科，河南南陽 473000；南陽市中心醫院普外科，河南南陽 473000）

皮膚完全覆蓋于人體表面，構成了人類第一道免疫屏障[1]。隨著生態環境的惡化，臭氧層被破壞，人類暴露于嚴重的紫外線（ultraviolet，UV）輻射下[2]。長期慢性的紫外線輻射會造成皮膚細胞脂質過氧化物增多，膠原蛋白降解，從而引起皮膚光老化[3]。目前，延緩皮膚衰老的有效方法主要是減少自由基的產生、清除老化代謝產物、提高抗氧化酶活性等[4]。在中藥中尋找高效、無副作用的天然自由基清除劑已成為研究熱點。人參為五加科植物人參Panax ginsengC. A. Mey. 的根，味甘、微苦，性溫，入脾、肺經，可補氣固脫，補肺益脾，生津，安神，益智。人參具有抗應激作用，能提高機體對各種有害刺激（如溫度或氣壓的過高、過低，各種有毒的化學物質、微生物、放射線或移植癌等）的非特異性抵抗力，對免疫系統有雙向調節的正性作用。人參皂苷Rbl是人參有效成分之一，藥理學研究表明，人參皂苷Rbl能夠抑制心、腦、肝組織中過氧化脂質形成，穩定細胞膜結構，具有延緩神經細胞衰老、抗癌等作用[5-6]。為探討人參皂苷Rbl對皮膚光老化的治療作用，本研究建立了皮膚光老化小鼠模型，觀察人參皂苷Rb1對小鼠皮膚光老化氧化應激的改善作用，以及核因子E2相關因子2（Nrf2）/血紅素氧合酶1（HO-1）信號通路在其中發揮的作用，旨在為皮膚光老化的臨床治療提供理論指導，現將研究結果報道如下。

1 材料與方法

1. 1 實驗動物 SPF 級6 周齡雄性昆明種小鼠85 只，體質量16 ～ 20 g，動物質量合格證號：SCXK（滬）2018-0004，購自上海杰思捷實驗動物有限公司。于清潔通風、溫度18 ～ 22 ℃、濕度50%～60%、明暗周期12 h/12 h循環的環境中適應性飼養7 d。實驗在南陽市中心醫院檢驗科實驗室完成。

1. 2 藥物、試劑與儀器 人參皂苷Rb1（批號：20181125）購自南京廣潤生物制品有限公司；維生素E（批號：20190512）購自上海源葉生物科技有限公司。腫瘤壞死因子α（TNF-α）、白細胞介素6（IL-6）、白細胞介素1β（IL-1β）酶聯免疫吸附分析（ELISA）試劑盒，超氧化物歧化酶（SOD）、丙二醛（MDA）試劑盒，美國Thermo Fisher Scientific 公司；兔抗小鼠Nrf2、Kelch樣環氧氯丙烷相關蛋白1（Keap1）、HO-1 單克隆抗體，山羊抗兔辣根過氧化物酶標記的免疫球蛋白（IgG）抗體，英國Abcam公司。

1. 3 光源 紫外燈管由北京電光源研究所制造，6 根長波紫外線（UVA）燈管和1 根中波紫外線（UVB）燈管，每根40 W。UVA 和UVB 劑量用紫外線強度測定儀（北京師范大學光電研究所制造）測定；HBS-1096C酶標分析儀（南京德鐵實驗設備有限公司）。

1.4 造模與分組 隨機選取70只小鼠建立皮膚光老化模型[7]，剃去小鼠背部約5 cm×5 cm面積的毛發，使皮膚充分暴露。將小鼠置于40 W 紫外線燈管（UVA+UVB）下照射，照射距離為40 cm，每隔1 d 照射1 次，每次照射40 min，連續照射40 d，UVB 累計照射劑量78.4 J，UVA 累計照射劑量98.4 J。小鼠出現慵懶、倦怠、蜷縮、皮膚粗糙并伴有豬毛征出現，紋理加粗加深變大，皮膚顏色開始暗紅等表現則視為造模成功。將造模成功的59 只小鼠隨機分為模型組15 只，人參皂苷Rb1低、高劑量組各15 只，陽性對照組14 只，剩余15只為正常組。

1. 5 干預方法 建模成功后第2 天，人參皂苷Rb1低、高劑量組小鼠分別給予灌胃50、100 mg/kg人參皂苷Rb1[7]，陽性對照組小鼠給予維生素E30mg/kg灌胃，正常組和模型組小鼠灌胃等體積生理鹽水，每天1 次，共30 d[8]。末次灌胃結束后，所有大鼠背部皮膚拍照，根據圖片采用皮膚皺紋等級量表進行評分，見表1。

表1 皮膚皺紋等級量表Table 1 Skin wrinkle rating scale

1.6 觀察指標與方法

1.6.1 組織取材 拍照結束后，各組小鼠采用30 g/L戊巴比妥鈉按照30 mg/kg 腹腔注射麻醉，眼球取血4 mL，置于抗凝管中，以3 000 r/min，離心半徑8 cm，離心10 min。取血漿保存于-20 ℃。所有小鼠剝取暴露在外的皮膚，一部分置于40 g/L多聚甲醛中固定，另一部分液氮速凍后置于-80 ℃冰箱中保存。

1.6.2 測定SOD活性和MDA水平 取-20 ℃的血漿，按照SOD 試劑盒說明書加樣，用黃嘌呤氧化酶法測定SOD 水平，全自動酶標儀測出550 nm 波長處的吸光度（OD）值。根據說明書上的公式：SOD樣品比活力（U/mL）=（對照管OD值-測定管OD值）/對照管OD值÷50%÷加樣量×透析液體積。

取保存在-20 ℃冰箱中的血漿，按照MDA 試劑盒說明書加樣，用硫代巴比妥酸法測定MDA 水平，全自動酶標儀測出450、532、600 nm 波長處的OD 值。根據說明書上的公式：MDA（μmol·L-1）=6.452 × [OD（532 nm）- OD（600 nm）]-0.56×OD（450 nm）。

1. 6. 3 ELISA 法測定血漿TNF-α、IL-6 和IL-1β水平 取保存在-20 ℃冰箱中的血漿，測定TNF-α、IL-6 和IL-1β 水平，按照ELISA 試劑盒說明書加樣，采用全自動酶標儀測定450 nm 波長處的OD值，通過繪制標準曲線得出TNF-α、IL-6和IL-1β的濃度。

1.6.4 測量小鼠表皮厚度 在光學顯微鏡下，選取小鼠皮膚組織切片標本3～5 個視野，用顯微鏡配套微尺測量表皮厚度，以mm為計數單位，取均值。

1. 6. 5 蘇木素-伊紅（HE）染色法觀察小鼠皮膚組織病理學變化 取40 g/L多聚甲醛固定的皮膚組織，常規脫水，石蠟包埋，切片（厚度2 μm），HE染色，光學顯微鏡下觀察小鼠皮膚組織病理學變化。

1.6.6 蛋白免疫印跡（Western Blot）法檢測皮膚組織Nrf2、Keap1、HO-1蛋白表達水平 取-80 ℃保存的皮膚組織80 mg，液氮速凍研磨，加入蛋白提取裂解液，冰上裂解，離心，取上清，用二喹啉甲酸（BCA）法進行蛋白定量。加入十二烷基硫酸鈉（SDS）上樣緩沖液，95 ℃水浴使蛋白變性，進行SDS-聚丙烯酰胺凝膠電泳（PAGE），電轉至聚偏氟乙烯（PVDF）膜。50 g/L 脫脂牛奶室溫封閉2 h。洗膜后分別加入1∶1 000 稀釋的Nrf2、Keap1、HO-1一抗，4 ℃孵育過夜。洗膜后加入1∶4 000稀釋的辣根過氧化物酶標記的二抗，室溫孵育1 h。洗膜后加入電化學發光液（ECL）顯影。采用ImageJ軟件分析圖像，以β-actin 為內參，Nrf2、Keap1、HO-1 相對表達量用其蛋白條帶灰度值與β-actin蛋白條帶灰度值的比值表示。

1.7 統計方法 采用SPSS 24.0統計學軟件分析數據，計量資料以均數±標準差（±s）表示，多組比較采用單因素方差分析，兩兩樣本比較采用LSD-t檢驗。以P＜0.05為差異有統計學意義。

2 結果

2.1 各組小鼠血漿SOD活性和MDA水平比較 表2結果顯示：與正常組比較，模型組，人參皂苷Rb1低、高劑量組和陽性對照組血漿SOD 活性降低，MDA水平升高（P＜0.05）；與模型組比較，人參皂苷Rb1 低、高劑量組和陽性對照組血漿SOD 活性升高，MDA 水平降低（P＜0.05），但人參皂苷Rb1低、高劑量組血漿SOD 活性低于陽性對照組（P＜0.05），MDA水平高于陽性對照組（P＜0.05）。

表2 各組小鼠血漿SOD活性和MDA水平比較Table 2 Comparison of plasma SOD activity and MDA level in various groups（±s）

表2 各組小鼠血漿SOD活性和MDA水平比較Table 2 Comparison of plasma SOD activity and MDA level in various groups（±s）

①P ＜0.05，與正常組比較；②P ＜0.05，與模型組比較；③P ＜0.05，與陽性對照組比較

MDA（μmol·L-1）6.84±1.45 38.58±3.58①26.64±2.87①②③17.41±2.17①②③10.26±1.89①②組別正常組模型組人參皂苷Rb1低劑量組人參皂苷Rb1高劑量組陽性對照組鼠數（只）15 15 15 15 14 SOD（U·mL-1）156.37±11.62 38.47±6.68①66.33±7.11①②③87.53±8.31①②③110.48±10.28①②

2. 2 各組小鼠血漿TNF-α、IL-6 和IL-1β 水平比較 表3結果顯示：與正常組比較，模型組，人參皂苷Rb1 低、高劑量組和陽性對照組血漿TNFα、IL-6 和IL-1β 水平升高（P＜0.05）；與模型組比較，人參皂苷Rb1 低、高劑量組和陽性對照組血漿TNF-α、IL-6 和IL-1β 水平降低（P＜0.05），但人參皂苷Rb1 低、高劑量組血漿TNF-α、IL-6 和IL-1β水平均高于陽性對照組（P＜0.05）。

表3 各組小鼠血漿TNF-α、IL-6和IL-1β水平比較Table 3 Comparison of plasma levels of TNF-α，IL-6 and IL-1β in various groups（±s，ng·L-1）

表3 各組小鼠血漿TNF-α、IL-6和IL-1β水平比較Table 3 Comparison of plasma levels of TNF-α，IL-6 and IL-1β in various groups（±s，ng·L-1）

①P ＜0.05，與正常組比較；②P ＜0.05，與模型組比較；③P ＜0.05，與陽性對照組比較

組別正常組模型組人參皂苷Rb1低劑量組人參皂苷Rb1高劑量組陽性對照組IL-1β 98.58±16.45 264.38±26.14①187.43±19.37①②③143.58±15.46①②③123.63±17.45①②鼠數（只）15 15 15 15 14 TNF-α 108.62±18.52 259.52±25.53①223.17±23.43①②③180.67±19.71①②③153.73±19.56①②IL-6 68.25±10.78 174.63±17.68①132.67±14.53①②③112.19±12.48①②③81.37±11.49①②

2.3 各組小鼠皮膚組織病理學變化比較 圖1 結果顯示：正常組小鼠皮膚表皮層結構完整，細胞分層清晰，真皮層纖維組織成波浪形，排列有序，分布均勻；模型組小鼠表皮層角質層增厚，細胞分層不清，真皮層纖維組織排列紊亂，分布不均，有大量炎性細胞浸潤；人參皂苷Rb1 低、高劑量組皮膚病理學變化得到改善，但仍可見表皮角質層增厚，真皮層纖維組織斷裂、破碎，卷曲扭結；陽性對照組表皮稍有增厚，真皮層可見較完整的纖維組織，少見斷裂、破碎，未出現卷曲扭結。

圖1 各組小鼠皮膚組織病理學變化比較（HE染色法，×100）Figure 1 Comparison of skin pathological changes of mice in various groups（by HE staining，×100）

2.4 各組小鼠皮膚表皮厚度及皺紋形成比較 表4結果顯示：與正常組比較，模型組、人參皂苷Rb1低、高劑量組和陽性對照組皮膚表皮厚度升高（P＜0.05）；與模型組比較，人參皂苷Rb1 低、高劑量組和陽性對照組皮膚表皮厚度及紋理評分降低（P＜0.05），但人參皂苷Rb1 低、高劑量組皮膚表皮厚度及紋理評分高于陽性對照組（P＜0.05）。

表4 各組小鼠表皮厚度及皺紋形成比較Table 4 Comparison of skin thickness and wrinkle formation in various groups（±s）

表4 各組小鼠表皮厚度及皺紋形成比較Table 4 Comparison of skin thickness and wrinkle formation in various groups（±s）

①P ＜0.05，與正常組比較；②P ＜0.05，與模型組比較；③P ＜0.05，與陽性對照組比較

皮膚紋理評分（分）—2.67±0.51 2.25±0.43②③1.73±0.37②③1.06±0.35②組別正常組模型組人參皂苷Rb1低劑量組人參皂苷Rb1高劑量組陽性對照組鼠數（只）15 15 15 15 14表皮厚度（mm）0.46±0.06 1.78±0.17①1.42±0.14①②③1.10±0.11①②③0.78±0.08①②

2.5 各組皮膚組織Nrf2、Keap1、HO-1 蛋白相對表達水平 圖2、表5 結果顯示：與正常組比較，模型組，人參皂苷Rb1 低、高劑量組和陽性對照組皮膚組織Nrf2、Keap1、HO-1 蛋白相對表達水平降低（P＜0.05）；與模型組比較，人參皂苷Rb1低、高劑量組和陽性對照組皮膚組織Nrf2、Keap1、HO-1 蛋白相對表達水平升高（P＜0.05）；與模型組比較，人參皂苷Rb1 低、高劑量組和陽性對照組皮膚組織Nrf2、Keap1、HO-1 蛋白相對表達水平升高（P＜0.05），但人參皂苷Rb1 低、高劑量組皮膚組織Nrf2、Keap1、HO-1 蛋白相對表達水平低于陽性對照組（P＜0.05）。

表5 各組小鼠皮膚組織Nrf2、Keap1、HO-1蛋白相對表達水平比較Table 5 Comparison of the relative protein expression levels of Nrf2，Keap1，HO-1 in skin tissues of various groups（±s）

表5 各組小鼠皮膚組織Nrf2、Keap1、HO-1蛋白相對表達水平比較Table 5 Comparison of the relative protein expression levels of Nrf2，Keap1，HO-1 in skin tissues of various groups（±s）

①P ＜0.05，與正常組比較；②P ＜0.05，與模型組比較；③P ＜0.05，與陽性對照組比較

組別正常組模型組人參皂苷Rb1低劑量組人參皂苷Rb1高劑量組陽性對照組HO-1 1.19±0.12 0.33±0.06①0.62±0.07①②③0.78±0.09①②③0.99±0.10①②鼠數（只）15 15 15 15 14 Nrf2 1.21±0.12 0.43±0.07①0.61±0.08①②③0.79±0.08①②③1.02±0.11①②Keap1 1.01±0.10 0.31±0.06①0.45±0.08①②③0.63±0.08①②③0.80±0.09①②

圖2 各組小鼠皮膚組織Nrf2、Keap1、HO-1蛋白的Western Blot電泳條帶Figure 2 Western blotting strips of Nrf2，Keap1 and HO-1 proteins in skin tissues of various groups

3 討論

皮膚光老化是指長期受到日光紫外線照射而發生的皮膚松弛干燥，色素沉著異常及皺紋增多等一系列皮膚衰老的癥狀。紫外線是造成皮膚光老化的主要原因。尋找和開發能有效防治皮膚光老化的天然產物已受到廣泛關注。

由于倫理學限制，對于光老化的研究目前僅限于實驗動物光老化模型，尤其是以大鼠或小鼠建立的光老化模型在皮膚組織形態學的變化與人類相似。因此，本研究以小鼠為研究對象，采用UVA 和UVB 混合紫外線照射建立光老化模型。UVA 是引起色素沉著異常的主要因素，而UVB 是引起紅斑、皺紋粗糙加深的主要原因。本研究中模型組小鼠皮膚表皮厚度增加且紋理評分升高，說明皮膚光老化小鼠模型制備成功。正常的皮膚組織需要膠原纖維及彈力蛋白維持正常的強度和彈性，紫外線照射則會引起膠原降解、膠原蛋白合成減少等改變，導致異常變性的膠原蛋白沉積，皮膚則出現老化外觀[9]。本研究結果顯示，模型組小鼠皮膚表皮層角質層增厚，細胞分層不清，真皮層纖維組織排列紊亂，分布不均，有大量炎性細胞浸潤。

長期紫外線照射會引起氧化應激和炎癥反應，導致真皮細胞外基質降解和表皮增生，最終發生光老化。活性氧生成過多或代謝障礙，造成活性氧含量超出了機體抗氧化系統清除能力，直接導致氧化應激，從而引起細胞病理性損傷。為維持機體活性氧動態平衡，機體則會激活抗氧化相關蛋白，其中，SOD 是重要的抗氧化金屬酶，可清除機體氧自由基，維持氧化和抗氧化系統的平衡，其活性反映機體氧化應激的嚴重程度。MDA 是發生氧化應激時的重要指標，與氧化應激的嚴重程度直接相關[10]。目前，關于紫外線所導致的皮膚光老化相關機制的理論有3 種：（1）紫外線照射造成皮膚細胞釋放自由基和炎癥因子，造成皮膚各種細胞內部結構相互作用，導致細胞和組織損傷。（2）紫外線照射損傷DNA，引起細胞凋亡和癌變等不良后果。（3）紫外線照射還可使皮膚蛋白質，如膠原蛋白，發生交聯反應；誘導反式尿苷酸向順式轉化，從而釋放腫瘤壞死因子。其中，炎癥反應被認為是造成紫外線照射光損傷的重要因素。TNF-α 是炎癥反應中最早出現的炎性因子，通過激活中性粒細胞和淋巴細胞，促進血管內皮細胞通透性，可促使其他細胞因子合成和釋放。IL-6 可誘導B 細胞分化并產生抗體，還可誘導T細胞增殖活化，參與機體免疫應答，在炎癥反應中起到促發劑的作用。IL-1β通過激活核因子kappaB（NF-κB）炎性信號通路促進炎癥反應。本研究應用人參皂苷Rb1 對皮膚光老化小鼠進行治療后，結果顯示：與模型組比較，人參皂苷Rb1組小鼠皮膚表皮厚度和紋理評分降低，皮膚損傷改善，但仍可見表皮角質層輕度增厚，真皮層纖維組織不同程度斷裂、破碎，卷曲扭結，SOD 活性升高，MDA 含量降低，IL-6、IL-1β 和TNF-α含量降低，且具有劑量依賴性。表明人參皂苷Rb1對皮膚光老化小鼠具有改善作用，但是，人參皂苷Rb1治療的效果不如陽性對照藥物。

Nrf2是調節抗氧化應激的重要轉錄因子，正常生理狀況下Nrf2 在細胞內被快速降解，發生氧化應激時，與Keap1偶聯結合，穩定狀態下的Nrf2轉位入細胞核結合抗氧化反應原件如HO-1，促進抗氧化蛋白基因的轉錄和表達，增強細胞抗氧化能力，降低活性氧及炎癥反應，從而發揮保護細胞正常功能的作用[11]。研究表明，衰老過程中Nrf2及其靶基因的表達均下調，而Nrf2/HO-1通路的激活可以上調許多抗氧化基因的表達，減輕組織氧化損傷[12]。尤旭等[13]研究發現，衰老大鼠睪丸組織中Nrf2 及其下游靶蛋白HO-1 和NQO1 的表達降低，提示Nrf2/HO-1信號通路參與細胞衰老過程。王斌等[14]研究發現，Nrf2/HO-1 信號通路參與梗阻性腎病大鼠腎臟氧化應激損傷。本研究結果顯示，模型組小鼠皮膚組織中Nrf2、Keap1 和HO-1 蛋白表達較正常組降低，不同劑量人參皂苷Rb1 治療后Nrf2、Keap1 和HO-1 蛋白表達升高，表明人參皂苷Rb1可能是通過激活Nrf2/HO-1信號通路發揮抗氧化作用。

綜上所述，人參皂苷Rb1 可在一定程度上減輕皮膚光老化小鼠體內氧化應激水平，促進光老化皮膚修復，其機制可能與激活Nrf2/HO-1信號通路有關。