解郁健脾補腎方對大鼠高催乳素血癥的干預作用

鄧芳， 高修安， 許麗綿

（1.佛山市婦幼保健院，廣東佛山 528000；2.廣州中醫(yī)藥大學第一附屬醫(yī)院，廣東廣州 510405）

高催乳素血癥（hyperprolactinemia）是指血清催乳素（prolactin，PRL）＞25 μg/L。女性常常表現(xiàn)為月經過少、閉經，甚至不孕、復發(fā)性流產等，嚴重影響生殖健康[1-2]。目前治療高催乳素血癥，西醫(yī)首選療效確切的溴隱亭；因垂體微腺瘤引起的高催乳素血癥，常選擇手術治療。但臨床上，約12%的患者難于耐受溴隱亭所引起的頭暈、幻覺等副作用，且其停藥后復發(fā)率高[3]，而手術治療存在垂體功能降低、下丘腦損傷等并發(fā)癥，治療費用多難以承受。因此，有必要探尋更經濟安全的治療方法。中醫(yī)學在治療高催乳素血癥方面積累了豐富的經驗。本課題組前期應用疏肝法、溫腎法治療高催乳素血癥，取得了一定的療效[4-5]，為進一步探討解郁健脾補腎方對高催乳素血癥的干預作用，本研究復制了高催乳素血癥大鼠模型進行分子水平研究，現(xiàn)將研究結果報道如下。

1 材料與方法

1.1 動物 60只SPF級6周齡SD雌性大鼠，體質量（200 ± 10）g，由廣東省實驗動物中心提供，動物質量合格證號：SCXK（粵）2018-0002。于廣州中醫(yī)藥大學第一附屬醫(yī)院實驗中心飼養(yǎng)，室溫控制在22～24 ℃，濕度45%～65%，換氣次數(shù)10～15次/h，每日照射明光12 h、暗光12 h。實驗前適應性飼養(yǎng)7 d。

1. 2 藥物 解郁健脾補腎方由柴胡15 g、白芍10 g、麥芽10 g、凌霄花10 g、黨參15 g、白術15 g、茯苓10 g、桑寄生15 g、杜仲10 g、巴戟天10 g組成。上述中藥飲片由佛山市婦幼保健院中藥房提供，所有藥材均由高修安教授鑒定為正品，符合《中國藥典》2015年版[6]規(guī)定。由廣州中醫(yī)藥大學第一附屬醫(yī)院實驗室煎煮并濃縮，保存于2～8 ℃冰箱內備用。

1.3 試劑與儀器 溴隱亭（匈牙利吉瑞藥廠，進口藥品批號：H20160170）；滅吐靈（甲氧氯普胺）（湖北萬得化工有限公司生產，CAS號：4093-35-0）；PRL、雌二醇（E2）、人促卵泡生成素（FSH）放射免疫分析試劑盒（北方生物技術研究所）；轉錄信號轉導子與激活子5（STAT5）抗體（北京百奧萊博公司）；辣根過氧化物酶標記的山羊抗兔免疫球蛋白（IgG）抗體（北京中西華大公司）。SpectraMax i3x多功能酶標儀（美谷分子公司）；TL988-IV實時熒光定量PCR 儀（上海啟前電子科技有限公司）；紫外分光光度計（上海菁華科技有限公司）；AlphaImager HP 凝膠成像分析系統(tǒng)（美國AlphaInnotech 公司）；計算機圖像分析儀（Image-Pro Plus Analysis Soft ware）。

1.4 動物分組、造模與給藥 將60只大鼠隨機選10 只作為正常組，其余50 只大鼠構建高催乳素模型。造模方法[7]：皮下注射滅吐靈（多巴胺受體阻斷劑）50 mg/kg，每日1 次，連續(xù)注射10 日。依據文獻[8]，PRL值為正常參考值的3倍以上，即可判定造模成功。造模第11 天取血測量血清PRL 水平，均＞100 μg/L，則提示造模成功。將全部造模成功的50 只大鼠，隨機分為模型組，陽性藥物組，中藥低、中、高劑量組，每組10 只。于實驗第12～21 天進行藥物干預：按照“人與動物體表面積折算等效劑量比率表”，陽性藥物組給予溴隱亭2.0 mg·kg-1·d-1灌胃，中藥低、中、高劑量組分別給予解郁健脾補腎方12.6、25.2、50.4 g·kg-1·d-1灌胃，正常組和模型組給予等體積蒸餾水灌胃，每日2次（早晚8時），共灌胃10 d。

1.5 觀察指標與方法

1.5.1 采集標本 行大鼠陰道涂片示排卵后，用100 g/L 水合氯醛腹腔麻醉大鼠，腹主動脈采血，離心分離血清，保存于-20 ℃的冰箱中。摘取卵巢組織剝除干凈周圍的脂肪，存于-80 ℃的冰箱中。

1. 5. 2 檢測血清PRL、FSH、E2水平 采用放射免疫法檢測血清PRL、E2、FSH水平，具體操作方法按照相關試劑盒說明書進行。

1.5.3 蛋白免疫印跡（Western Blot）法檢測卵巢組織STAT5 的表達 提取卵巢組織蛋白后，制膠、上樣、電泳處理，電轉移、膜封閉，用TBS-T 洗滌膜10 min×3 次，轉移至雜交袋，滴加一抗4 ℃孵育過夜；再用TBS-T洗滌膜10 min×3次，轉移至新的雜交袋，滴加二抗37 ℃孵育1 h；TBS-T繼續(xù)洗滌膜10 min × 3 次，膜表面用電化學發(fā)光液（ECL）覆蓋，聚偏氟乙烯（PVDF）膜每cm2至少需要0.125 mL ECL 液才能基本被覆蓋。包好，蛋白吸附面向上，放入X 光盒中曝光數(shù)分鐘后，立刻浸入顯影液，出現(xiàn)條帶顯影后清水漂洗，浸入定影液中定影、晾干，掃描分析并保存。

1.5.4 實時定量聚合酶鏈反應（PCR）法檢測催乳素受體（PRLR）mRNA 表達 獲取卵巢RNA 提取物，進行體外反轉與PCR。離心管內加入以下物質3 μL RNA、1 μL Oligo（dT）引物、9.5 μL ddH2O進行DEPC 定容；70 ℃水浴5 min 后置于冰上，離心后繼續(xù)加入5 μL 5×Buffer、5 μL dNTP、0.5 μL Ribonuclease Inhibitor、1 μL M-MLV RT；短暫離心后42 ℃水浴60 min 再70 ℃水浴10 min，在離心管內加入1.5 μL cDNA、0.5 μL濃度為10 pmol/μL引物1、0.5 μL 濃度為10 pmol/μL 引物2、10 μL SYBR-Green Mix、ddH2O 補水至20 μL。PCR 程序為94 ℃預變性10 min，再94 ℃15 s、60 ℃1 min、72 ℃10 min共45個循環(huán)。采用2-ΔΔCT法計算目的基因相對定量結果。PCR引物信息見表1。

表1 PCR引物信息Table 1 PCR primer information

1. 6 統(tǒng)計方法 采用SPSS 22.0 統(tǒng)計軟件進行數(shù)據分析。計量資料以均數(shù)±標準差（±s）表示，多組間比較采用單因素方差分析，兩組間比較采用獨立樣本t檢驗。以P＜0.05 為差異有統(tǒng)計學意義。

2 結果

2. 1 各組大鼠血清PRL 水平比較 表2 結果顯示：與正常組比較，模型組的血清PRL 值明顯升高，差異有統(tǒng)計學意義（P＜0.05）；與模型組比較，中藥低、中、高劑量組及陽性藥物組PRL 值明顯降低，差異均有統(tǒng)計學意義（P＜0.05）；中藥各劑量組血清PRL 值與陽性藥物組比較，差異均無統(tǒng)計學意義（P＞0.05）。

表2 各組大鼠血清PRL水平比較Table 2 Comparison of serum PRL level of rats in various groups（±s）

表2 各組大鼠血清PRL水平比較Table 2 Comparison of serum PRL level of rats in various groups（±s）

①P＜0.05，與正常組比較；②P＜0.05，與模型組比較

組別正常組模型組陽性藥物組中藥低劑量組中藥中劑量組中藥高劑量組PRL（ng·mL-1）20.20±3.01 97.60±2.17①17.10±1.37②18.30±1.06②17.30±1.34②17.50±1.08②鼠數(shù)（只）10 10 10 10 10 10

2.2 各組大鼠血清E2、FSH 水平比較 表3 結果顯示：與正常組比較，模型組的E2、FSH值顯著降低，差異均有統(tǒng)計學意義（P＜0.05）；與模型組比較，中藥低、中、高劑量組及陽性藥物治療組E2、FSH 值明顯升高，差異均有統(tǒng)計學意義（P＜0.05）；中藥各劑量組血清E2、FSH 值與陽性藥物組比較，差異均無統(tǒng)計學意義（P＞0.05）。

表3 各組大鼠血清E2、FSH比較Table 3 Comparison of serum E2 and FSH levels of rats in various groups（±s）

表3 各組大鼠血清E2、FSH比較Table 3 Comparison of serum E2 and FSH levels of rats in various groups（±s）

①P＜0.05，與正常組比較；②P＜0.05，與模型組比較

組別正常組模型組陽性藥物組中藥低劑量組中藥中劑量組中藥高劑量組FSH（mIU·mL-1）7.17±0.18 3.81±0.15①5.12±0.10②5.04±0.13②5.89±0.36②5.20±0.15②鼠數(shù)（只）10 10 10 10 10 10 E2（pg·mL-1）72.10±1.79 40.10±2.38①53.50±2.37②55.40±1.71②66.80±2.15②56.80±2.30②

2.3 各組大鼠卵巢組織STAT5蛋白表達比較 表4、圖1 結果顯示：與正常組比較，模型組卵巢組織STAT5 蛋白表達水平降低，差異有統(tǒng)計學意義（P＜0.05）；與模型組比較，中藥低、中、高劑量組及陽性藥物組卵巢組織STAT5 蛋白表達水平升高，差異均有統(tǒng)計學意義（P＜0.05）；中藥中劑量組卵巢組織STAT5 蛋白表達水平明顯高于陽性藥物組，但仍低于正常組，差異有統(tǒng)計學意義（P＜0.05）。

圖1 各組大鼠卵巢組織STAT5蛋白電泳條帶Figure 1 Electrophoresis bands of STAT5 protein in ovarian tissue of rats in various groups

表4 各組大鼠卵巢組織STAT5表達比較Table 4 Comparison of STAT5 protein expression in ovarian tissue of rats in various groups （±s）

表4 各組大鼠卵巢組織STAT5表達比較Table 4 Comparison of STAT5 protein expression in ovarian tissue of rats in various groups （±s）

①P＜0.05，與正常組比較；②P＜0.05，與模型組比較；③P＜0.05，與陽性藥物組比較

STAT5 1.04±0.27 0.54±0.10①0.69±0.12①②0.78±0.13①②0.97±0.20①②③0.87±0.18①②組別正常組模型組陽性藥物組中藥低劑量組中藥中劑量組中藥高劑量組鼠數(shù)（只）10 10 10 10 10 10

2.4 各組大鼠卵巢組織PRLR mRNA表達比較 表5結果顯示：與正常組比較，模型組卵巢組織PRLR mRNA 表達水平降低，差異有統(tǒng)計學意義（P＜0.05）；與模型組比較，中藥低、中、高劑量組及陽性藥物組卵巢組織PRLR mRNA 表達水平升高，差異均有統(tǒng)計學意義（P＜0.05）；中藥中劑量組PRLR mRNA 表達水平明顯高于陽性藥物組，但仍低于正常組，差異均有統(tǒng)計學意義（P＜0.05）。

表5 各組大鼠卵巢組織PRLR mRNA表達比較Table 5 Comparison of PRLR mRNA expression in ovarian tissue of rats in various groups（±s）

表5 各組大鼠卵巢組織PRLR mRNA表達比較Table 5 Comparison of PRLR mRNA expression in ovarian tissue of rats in various groups（±s）

①P＜0.05，與正常組比較；②P＜0.05，與模型組比較；③P＜0.05，與陽性藥物組比較

PRLR mRNA相對表達量1.09±0.20 0.39±0.06①0.50±0.04①②0.45±0.07①②0.67±0.10①②③0.52±0.12①②組別正常組模型組陽性藥物組中藥低劑量組中藥中劑量組中藥高劑量組鼠數(shù)（只）10 10 10 10 10 10

3 討論

催乳素（PRL）是一種重要的內分泌激素，垂體外合成PRL 的部位主要在子宮內膜，它通過相關信號通路參與子宮內膜的血管生成與分化，支持黃體功能，并與子宮內膜容受性有關[9]。卵泡液中PRL的濃度與雌激素E2濃度相關，PRL基因缺失可使E2水平低下，竇狀卵泡個數(shù)少，囊胚不易著床[10]。PRL發(fā)揮生殖調節(jié)功能依賴于PRLR，PRLR表達的部位主要有3 個：非孕期分泌期子宮內膜、蛻膜化子宮內膜基質、卵巢組織[11-12]。適當濃度的PRL與PRLR結合，可調節(jié)顆粒細胞FSH受體的表達，促進卵泡發(fā)育及孕酮的生成。PRL/PRLR介導蛋白酪氨酸激酶2（JAK2）、信號轉導子與激活子5（STAT5）信號傳導途徑廣泛參與細胞增殖、分化以及免疫調節(jié)過程，是多種生長因子和細胞因子傳導信號的重要途徑[13]，PRL 和PRLR 結合后激活細胞內JAK2，STAT5是JAK2作用的底物，STAT5亦是PRL 生成的重要因子[14]。PRL/PRLR-JAK2/STAT5 傳導通路，活化STAT5 反式作用因子，廣泛參與子宮內膜血管生成、分化，促進卵泡生長及排出，維持黃體[15-16]，上調子宮內膜α2 巨球蛋白、ERα、ERβ 的表達，參與蛻膜退化與重建[17]。已有研究表明：高催乳素血癥可抑制E2的分泌，同時降低E2受體的敏感性，不能形成排卵前的雌激素高峰影響排卵，使子宮內膜容受性降低，黃體功能下降，影響卵泡的發(fā)育及排出[18]；高催乳素血癥亦可改變PRL/PRLR-JAK2/STAT5 通路效應，降低孕激素酶級聯(lián)反應，抑制FSH 粒層細胞芳香化酶和雌激素分泌，可導致月經紊亂及卵巢功能降低[7，19]。

高泌乳素血癥并無對應的中醫(yī)學病名，其病因病機及辨證分型認識多有不同。多數(shù)醫(yī)家認為，該病病機主要為腎氣不足、肝郁氣滯、脾胃運化失常，涉及腎、脾、肝等臟腑，往往與氣滯、痰濕、血瘀相關，各因素互根互用[5]。本課題組綜合文獻研究與臨床經驗，擬制解郁健脾補腎方，方中柴胡入肝膽經，疏肝解郁、升舉陽氣，白芍疏肝理氣、柔肝養(yǎng)血，二者配伍可加強疏肝解郁之效；麥芽健脾消食，凌霄花散結、活血化瘀；黨參入脾經，健脾益肺，益氣生津，白術健脾燥濕化痰，固表止汗，茯苓健脾和胃，利水滲濕，黨參、白術、茯苓合用健脾和胃，增強體質；桑寄生入肝腎經，補肝腎，通經絡，杜仲常配巴戟天以補腎、壯筋骨、祛風濕。諸藥合用，共奏解郁健脾補腎之功，同時有行氣、化痰、祛瘀之效。現(xiàn)代藥理研究發(fā)現(xiàn)：柴胡含有的柴胡皂苷、柴胡醇、α-菠菜甾醇，均有護肝、保肝之效，對動物實驗性肝損傷亦有防治作用[20]；白芍中的白芍苷可以刺激卵巢顆粒細胞生成甾體類激素，亦有保肝、護肝的作用[21]；麥芽含有的麥角類化合物可結合下丘腦及其受體，類似多巴胺激動劑樣作用，使泌乳素釋放因子增強，抑制PRL 分泌[22]；黨參、茯苓、白術有調節(jié)機體免疫的功能[23]；桑寄生、巴戟天可促進下丘腦產生GnRH，增加垂體對GnRH 及LH-RH 的敏感性，進而刺激FSH、LH 抑制PRL 的產生，促進卵泡發(fā)育，提高血中E2的水平，從而調節(jié)機體內分泌平衡[24-25]。

本研究結果顯示：與正常組比較，模型組PRL值明顯升高，E2、FSH 水平，STAT5 蛋白、PRLR mRNA 表達水平均顯著降低（P＜0.05）。與模型組比較，中藥各劑量組PRL值均明顯降低，E2、FSH水平，STAT5 蛋白、PRLR mRNA 表達水平顯著增高（P＜0.05）。表明高催乳素血癥大鼠卵巢組織PRL/PRLR-JAK2/STAT5 信號傳導通路相關因子表達下降，可引起下丘腦-垂體-卵巢軸功能紊亂，抑制性激素的分泌；經解郁健脾補腎方治療，PRL 水平降低，PRL/PRLR-JAK2/STAT5 信號通路相關蛋白PRLR、STAT5 的表達增強，且與PRL 濃度有關。

綜上所述，解郁健脾補腎方可以有效改善高催乳素血病，提高PRL/PRLR-JAK2/STAT5 信號傳導通路相關因子PRLR、STAT5 的表達，進而促進卵泡發(fā)育，誘導排卵，從根本上調整性腺軸的功能，增強卵巢的內分泌調節(jié)，體現(xiàn)出中醫(yī)藥治療該病的優(yōu)勢和前景。