5種方法制備高尿酸血癥大鼠模型的實驗研究

陳建新， 劉剛， 楊麟， 陳亮， 池鳳蘇， 唐璐， 譚婧

（1.廣州中醫(yī)藥大學(xué)體育與健康學(xué)院，廣東廣州 510006；2.華南師范大學(xué)體育科學(xué)學(xué)院激光運動醫(yī)學(xué)實驗室，廣東廣州 510631；3.廣州醫(yī)科大學(xué)附屬中醫(yī)醫(yī)院藥學(xué)部，廣東廣州 511436）

高尿酸血癥（hyperuricemia）是由于尿酸排泄減少、嘌呤代謝紊亂和尿酸持續(xù)升高而引起單鈉尿酸鹽（monosodium urate）結(jié)晶體析出并沉積于組織或器官而表現(xiàn)的代謝性疾病[1]。1 項英國的臨床大數(shù)據(jù)結(jié)果顯示，高尿酸血癥與腎臟疾病有著緊密聯(lián)系[2]。有研究進一步揭示了慢性腎病可以預(yù)示高尿酸血癥高風(fēng)險的發(fā)生，而高尿酸血癥又加劇了慢性腎病的惡化[3]。因此，維持腎臟的正常尿酸水平有利于細胞抗氧化、神經(jīng)保護和維持穩(wěn)定血壓等效用[4-5]。由于高等靈長類動物缺乏編碼尿酸酶易導(dǎo)致高尿酸血癥[4]，而其他大多數(shù)動物體內(nèi)存在固有的尿酸酶可以降低尿酸的產(chǎn)生[3]，故建立以嚙齒類動物為主的高尿酸血癥動物模型是較困難的。本研究應(yīng)用不同造模藥物單用或聯(lián)合處理4周試圖建立穩(wěn)定且高效的高尿酸血癥動物模型，并觀察不同造模藥物對腎臟組織的損傷作用，現(xiàn)將研究結(jié)果報道如下。

1 材料與方法

1. 1 實驗動物 48 只SPF 級雄性SD（Sprague-Dawley）大鼠，（5±1）周齡，體質(zhì)量（160 ± 10）g，購自廣東省醫(yī)學(xué)實驗動物中心[SCXK（粵）2018-0002]，實驗動物喂養(yǎng)于廣州中醫(yī)藥大學(xué)大學(xué)城校區(qū)SPF 級動物實驗中心[SYXK（粵）2018-0085]。所有操作均根據(jù)美國國家衛(wèi)生研究院（NIH）發(fā)布的實驗室動物護理和使用指南（8th Edition，2011，ISBN 10：0-309-15400-6）進行，該實驗方案已通過廣州中醫(yī)藥大學(xué)動物實驗倫理學(xué)要求（審批號：20200717002）。動物分籠飼養(yǎng)，飼養(yǎng)室內(nèi)12 h 晝夜循環(huán)照明，溫度保持在22 ～ 26 ℃，濕度50%～60%，動物自由進食和飲水。

1.2 造模藥物、試劑與儀器 氧嗪酸鉀（potassium oxonate）（上海麥克林生化科技有限公司，批號：C11528491）；腺嘌呤（adenine）（上海源葉生物科技有限公司，批號：Y26J8C40561）；酵母膏（北京鼎國生物技術(shù)有限責(zé)任公司，批號：2665431-02）；羧甲基纖維素鈉（CMC-Na）（北京鼎國生物技術(shù)有限責(zé)任公司）；尿酸試劑盒（尿酸酶比色法）、尿素氮試劑盒（脲酶法）、尿肌酐試劑盒（尿肌酐比色法）（南京建成生物工程研究所有限公司）。Multiskan Mk3 型酶標儀[賽默飛世爾（上海）儀器有限公司]；離心機（美國Eppendorf公司）；全自動生化分析儀（日本Hitachi 公司）；ASP200S 全自動脫水機、5300 全自動染封一體機、RM2016輪轉(zhuǎn)式切片機（德國徠卡公司）。

1. 3 動物分組與造模 動物適應(yīng)性喂養(yǎng)1 周后，48 只SD 大鼠按體質(zhì)量隨機分為6 組，即正常對照組、氧嗪酸鉀組、腺嘌呤組、氧嗪酸鉀+腺嘌呤組、酵母膏+氧嗪酸鉀組以及酵母膏+腺嘌呤組，每組8只。所有組別均采用灌胃方式進行造模，灌胃液用5%羧甲基纖維素鈉（CMC-Na）為溶媒進行配制。造模同期，正常對照組給予CMC-Na 2 mL·d-1灌胃，氧嗪酸鉀組給予氧嗪酸鉀250 mg·kg-1·d-1灌胃，腺嘌呤組給予腺嘌呤200 mg·kg-1·d-1灌胃，氧嗪酸鉀+腺嘌呤組給予氧嗪酸鉀250 mg·kg-1·d-1與腺嘌呤200 mg·kg-1·d-1聯(lián)合灌胃，酵母膏+氧嗪酸鉀組給予酵母膏15 g·kg-1·d-1與氧嗪酸鉀250 mg·kg-1·d-1聯(lián)合灌胃，酵母膏+腺嘌呤組給予酵母膏15 g·kg-1·d-1與腺嘌呤200 mg·kg-1·d-1聯(lián)合灌胃。每日1次，連續(xù)造模4周。

1.4 標本制備 每周通過眼球叢取血。第4 周末給藥結(jié)束后12 h（禁食不禁水），以25 g/L戊巴比妥鈉麻醉大鼠，經(jīng)腹主動脈取血，處死留取腎臟標本。血液標本靜置30 min 后，于4 ℃離心機以10 000g離心10 min，取上層血清，放置于-80 ℃保存?zhèn)溆谩ＤI臟標本放置于40 g/L多聚甲醛中性溶液中固定。

1.5 生化指標檢測 運用全自動生化分析儀檢測血清尿酸（serum uric acid）、尿素氮（urea nitrogen）和肌酐（creatinine）水平，按照試劑盒與儀器操作說明書進行操作。

1.6 蘇木素-伊紅（HE）染色法觀察腎臟組織病理變化 將腎臟組織放置于多聚甲醛中固定24 h，經(jīng)梯度酒精脫水、石蠟包埋、切片、脫蠟、分化、制片（4 μm厚）、HE 染色，光學(xué)顯微鏡觀察并拍照。1. 7 統(tǒng)計方法 采用SPSS 22.0 軟件進行數(shù)據(jù)分析，計量數(shù)據(jù)以均數(shù)±標準差（±s）表示，進行正態(tài)分布檢驗和方差齊性檢驗后，多組間比較采用單因素方差分析，2 組間比較采用t檢驗，以P＜0.05為差異有統(tǒng)計學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 各組大鼠狀態(tài)、體質(zhì)量變化比較 造模1～4 周，正常對照組大鼠均反應(yīng)靈敏，皮毛致密有光澤，體質(zhì)量增長較快，而各造模組大鼠表現(xiàn)為精神萎靡，活動減少，反應(yīng)遲鈍，毛色焦黃且無光澤，應(yīng)激性較高，敏感且易怒，攻擊性也較強。

隨著造模時間的延長，所有組別大鼠體質(zhì)量均有所增加。造模第0 周，各組大鼠體質(zhì)量無明顯差異（P＞0.05）。造模從造模第1周開始到第4周結(jié)束，氧嗪酸鉀組、酵母膏+氧嗪酸鉀組和酵母膏+腺嘌呤組的體質(zhì)量顯著高于正常對照組、腺嘌呤組和氧嗪酸鉀+腺嘌呤組（P＜0.05）。具體結(jié)果見表1。

表1 各組大鼠體質(zhì)量比較Table 1 Comparison of body mass of rats in various groups（±s，g）

表1 各組大鼠體質(zhì)量比較Table 1 Comparison of body mass of rats in various groups（±s，g）

①P ＜0.05，與正常對照組比較；②P ＜0.05，與腺嘌呤組比較；③P ＜0.05，與氧嗪酸鉀+腺嘌呤組比較

組別正常對照組氧嗪酸鉀組腺嘌呤組氧嗪酸鉀+腺嘌呤組酵母膏+氧嗪酸鉀組酵母膏+腺嘌呤組造模第4周300±17 313±16①②③284±29 291±12 336±25①②③323±23①②③鼠數(shù)（只）888888造模第0周163±5 167±6 164±9 164±7 169±6 163±7造模第1周188±11 201±7①②③183±10 181±10 213±9①②③202±9①②③造模第2周230±16 255±6①②③216±20 214±16 269±16①②③245±15①②③造模第3周264±13 285±13①②③259±25 249±11 305±26①②③296±18①②③

2.2 各組大鼠血清尿酸水平比較 在為期4 周造模過程中，與正常對照組比較，所有造模組的尿酸值均顯著升高（P＜0.05），其中，氧嗪酸鉀+腺嘌呤組尿酸值最高（P＜0.05）。在造模第4 周，腺嘌呤組的尿酸值顯著高于正常對照組、氧嗪酸鉀組、酵母膏+氧嗪酸鉀組和酵母膏+腺嘌呤組（P＜0.05）。表明腺嘌呤單用或聯(lián)合氧嗪酸鉀構(gòu)建高尿酸血癥模型效果較好。具體結(jié)果見表2。

表2 各組大鼠血清尿酸水平比較Table 2 Comparison of serum uric acid level of rats in various groups（±s，μmol·L-1）

表2 各組大鼠血清尿酸水平比較Table 2 Comparison of serum uric acid level of rats in various groups（±s，μmol·L-1）

①P ＜0.05，與正常對照組比較；②P ＜0.05，與氧嗪酸鉀組比較；③P ＜0.05，與腺嘌呤組比較；④P ＜0.05，與酵母膏+氧嗪酸鉀組比較；⑤P ＜0.05，與酵母膏+腺嘌呤組比較

造模第4周118.36±15.74 157.41±23.59①184.37±32.62①②④⑤253.68±45.12①②③④⑤162.91±25.64①142.50±28.53①組別正常對照組氧嗪酸鉀組腺嘌呤組氧嗪酸鉀+腺嘌呤組酵母膏+氧嗪酸鉀組酵母膏+腺嘌呤組鼠數(shù)（只）888888造模第0周78.36±11.23 72.58±10.96 75.33±13.20 79.56±12.38 73.11±11.72 76.40±13.08造模第1周94.63±18.63 131.72±24.96①148.94±26.31①193.38±38.07①②③④⑤140.84±29.19①139.78±37.12①造模第2周105.16±23.24 152.22±26.09①167.78±32.31①223.45±40.13①②③④⑤159.85±27.42①153.71±31.69①造模第3周104.63±18.68 159.13±21.27①170.20±28.56①⑤249.52±39.34①②③④⑤165.18±27.32①157.45±20.39①

2.3 各組大鼠血清尿素氮水平比較 在造模4 周后，與正常對照組比較，所有造模組的尿素氮值均顯著升高（P＜0.05），其中，氧嗪酸鉀+腺嘌呤組的尿素氮值最高（P＜0.05），腺嘌呤組其次（P＜0.05）。表明腺嘌呤單用或聯(lián)合氧嗪酸鉀構(gòu)建高尿酸血癥模型效果較好。具體結(jié)果見表3。

表3 各組大鼠血清尿素氮水平比較Table 3 Comparison of serum urea nitrogen level of rats in various groups（±s，mmol·L-1）

表3 各組大鼠血清尿素氮水平比較Table 3 Comparison of serum urea nitrogen level of rats in various groups（±s，mmol·L-1）

①P ＜0.05，與正常對照組比較；②P ＜0.05，與氧嗪酸鉀組比較；③P ＜0.05，與腺嘌呤組比較；④P ＜0.05，與酵母膏+氧嗪酸鉀組比較；⑤P ＜0.05，與酵母膏+腺嘌呤組比較

造模第4周5.24±0.71 7.89±1.59①10.57±2.55①②④⑤12.57±2.86①②③④⑤10.91±2.38①②10.50±2.80①②組別正常對照組氧嗪酸鉀組腺嘌呤組氧嗪酸鉀+腺嘌呤組酵母膏+氧嗪酸鉀組酵母膏+腺嘌呤組鼠數(shù)（只）888888造模第0周4.31±0.81 4.14±0.69 4.19±0.92 4.40±0.94 4.06±0.56 3.96±0.78造模第1周4.88±0.73 4.67±0.89 5.87±1.09 7.61±0.83①②③④⑤5.34±1.13 5.01±1.04造模第2周4.79±0.69 4.93±1.29 8.32±2.11①②9.30±2.34①②③④⑤8.69±1.42①②8.74±1.89①②造模第3周4.82±0.89 6.31±1.17①9.97±2.36①②11.43±2.69①②③④⑤9.08±2.61①②9.45±2.06①②

2.4 各組大鼠血清肌酐水平比較 在4 周造模過程中，與正常對照組比較，所有造模組的肌酐都有顯著性升高（P＜0.05），其中，氧嗪酸鉀+腺嘌呤組的肌酐值最高（P＜0.05）。表明腺嘌呤聯(lián)合氧嗪酸鉀構(gòu)建高尿酸血癥模型效果較好。具體結(jié)果見表4。

表4 各組大鼠血清肌酐水平比較Table 4 Comparison of serum creatinine of rats in various groups（±s，μmol·L-1）

表4 各組大鼠血清肌酐水平比較Table 4 Comparison of serum creatinine of rats in various groups（±s，μmol·L-1）

①P ＜0.05，與正常對照組比較；②P ＜0.05，與氧嗪酸鉀組比較；③P ＜0.05，與腺嘌呤組比較；④P ＜0.05，與酵母膏+氧嗪酸鉀組比較；⑤P ＜0.05，與酵母膏+腺嘌呤組比較

造模第4周34.25±15.74 60.36±16.75①59.84±22.62①67.68±25.30①②③④⑤54.53±14.64①53.50±17.53①組別正常對照組氧嗪酸鉀組腺嘌呤組氧嗪酸鉀+腺嘌呤組酵母膏+氧嗪酸鉀組酵母膏+腺嘌呤組鼠數(shù)（只）888888造模第0周30.86±12.33 29.78±11.57 33.64±13.26 30.70±11.31 29.47±8.43 30.94±9.74造模第1周30.88±10.06 45.43±14.56①42.69±16.25①55.38±18.87①②③④⑤47.84±19.23①48.55±17.58①造模第2周31.23±13.78 52.14±18.09①56.78±32.31①63.89±20.24①②③④⑤53.69±17.94①55.97±12.28①造模第3周33.63±18.68 58.08±17.25①④57.30±28.56①④66.52±19.34①②③④⑤50.58±12.30①57.25±15.39①

2.5 各組大鼠腎臟組織病理學(xué)表現(xiàn)比較 圖1 肉眼結(jié)果顯示：正常對照組腎臟結(jié)構(gòu)完好，腎臟顏色暗紅，組織表面光澤度較高，外觀無腫脹現(xiàn)象；各造模組腎臟均較肥大，特別是腺嘌呤組與氧嗪酸鉀+腺嘌呤組腎臟外表有明顯結(jié)晶顆粒狀，腎臟顏色暗黃。HE染色結(jié)果顯示：正常對照組腎臟組織結(jié)構(gòu)正常，腎小管結(jié)構(gòu)正常，無異變，無結(jié)晶體積聚產(chǎn)生；各造模組均出現(xiàn)了腎小管排列不規(guī)則，且出現(xiàn)不同程度的尿酸鈉鹽結(jié)晶體積聚，其中，腺嘌呤組與氧嗪酸鉀+腺嘌呤組有大量尿酸鈉鹽結(jié)晶體積聚，腎小管周圍炎性細胞浸潤嚴重，上皮細胞胞質(zhì)空泡明顯。表明腺嘌呤單用或聯(lián)合氧嗪酸鉀對腎臟組織的損傷最為嚴重。

圖1 各組大鼠腎臟大體（A）及HE染色病理（B，×200）表現(xiàn)比較Figure 1 Comparison of kidney（A）and HE staining pathological features（B，×200）of rats in various groups

3 討論

尿酸是嘌呤（鳥嘌呤和腺嘌呤）和含嘌呤的化合物（如核酸、三磷酸腺苷）分解生成的嘌呤降解產(chǎn)物[6]。尿酸（主要為人體）和尿囊素（主要為嚙齒類動物）是肝臟中肝細胞嘌呤代謝的最終產(chǎn)物。尿酸可以通過肝臟（膽汁）排出，也可以通過腎臟（尿液）或腸道循環(huán)系統(tǒng)排出[7]。高尿酸血癥主要發(fā)生在包括人類在內(nèi)的高等靈長類動物中，主要是由于編碼尿酸酶（也稱尿酸氧化酶）基因失活導(dǎo)致的。尿酸酶是代謝尿酸轉(zhuǎn)化為水溶性尿囊素的3種酶序列中的第一種[3]，在靈長類動物進化過程中，該基因啟動子區(qū)域及蛋白質(zhì)編碼序列的多個獨立突變導(dǎo)致了基因沉默[3，8]。因此，高尿酸血癥的主要病理特征是當血清尿酸鹽（serum urate）濃度高于408 μmol/L且pH值高于7.4時就可以形成單鈉尿酸鹽結(jié)晶體，由于人體缺乏尿酸酶，致使尿酸鹽在腎臟和（或）腸道中過量生成或排泄不足[9]。因此，高尿酸血癥的發(fā)生主要有2種途徑，包括生成過多和排泄障礙。70%的亞洲人群高尿酸血癥患者為排泄障礙型，而排泄障礙型主要是尿酸在腎臟近端腎小管的重吸收出現(xiàn)障礙。導(dǎo)致的血尿酸水平異常升高，臨床上表現(xiàn)為肌酐升高或腎小球濾過率偏低，提示腎損傷是排泄障礙型高尿酸血癥的病理機制之一。從中醫(yī)學(xué)角度來看，緩解期高尿酸血癥患者多見脾腎兩虛，亦提示“腎”與高尿酸血癥有密切關(guān)系。因此認為，腎損傷可能是高尿酸血癥發(fā)生的重要原因。

建立高尿酸血癥動物模型主要通過2個途徑來進行，一是增加尿酸來源，二是抑制尿酸排出與抑制尿酸酶的活性[10-12]。本研究通過5 種造模方法——氧嗪酸鉀、腺嘌呤、氧嗪酸鉀聯(lián)合腺嘌呤、酵母膏聯(lián)合氧嗪酸鉀以及酵母膏聯(lián)合腺嘌呤構(gòu)建高尿酸血癥動物模型。其中，氧嗪酸鉀和酵母膏的作用途徑主要為增加尿酸來源，腺嘌呤的作用途徑為抑制尿酸排出與抑制尿酸酶的活性。本研究結(jié)果顯示，氧嗪酸鉀和酵母膏對大鼠體質(zhì)量的作用更加明顯。盡管肥胖是高尿酸血癥的一個重要相關(guān)因子[13-14]，但是從本研究具體的生化指標來看，兩者對高尿酸血癥的作用并不突出，因此，肥胖是否為高尿酸血癥的重要相關(guān)因素還有待進一步的考證。

尿酸、尿素氮和肌酐水平是判斷高尿酸血癥動物模型構(gòu)建成功與否的黃金指標[15-16]。孟笑瑋等[17]連續(xù)3 d 腹腔注射氧嗪酸鉀復(fù)制高尿酸血癥動物模型，發(fā)現(xiàn)存在血尿酸高于僅注射1 次的趨勢，但無顯著性差異。但再次重復(fù)這2個模型發(fā)現(xiàn)，尿酸水平升高不明顯。認為該種方法存在著較大的不穩(wěn)定性。楊桂梅等[18]使用氧嗪酸鉀灌胃10 d造模成功，但孟笑瑋等[17]的研究中使用相同方法未成功得到穩(wěn)定的高尿酸血癥動物模型。本研究結(jié)果發(fā)現(xiàn)，氧嗪酸鉀聯(lián)合腺嘌呤法對尿酸、尿素氮和肌酐3 個指標的作用尤為突出，從造模第1 周開始，不僅與正常對照組有顯著差異，而且與其余造模組都有顯著差異，這種優(yōu)勢也保持到了造模4周以后。此外，從病理切片結(jié)果也可以發(fā)現(xiàn)，嗪酸鉀聯(lián)合腺嘌呤造模組出現(xiàn)了大量腎尿酸鹽結(jié)晶沉積，腎小管變性及壞死，炎性細胞浸潤。因此，該聯(lián)合藥物對高尿酸血癥動物模型的建立具有重要的指導(dǎo)意義。

由于嚙齒類動物有固有的尿酸酶可以促進尿酸降解為尿囊素從而隨尿液排出[5，19]，故高尿酸血癥動物的建立是較為困難的。如果只是一過性的損傷，而非長期性給予刺激，則很難造模成功[7]。本研究結(jié)果顯示，從高尿酸血癥造模4 周過程來看，5 種造模方式造模成功的時間效應(yīng)具有差異性，其中，只有在第4周時高尿酸血癥動物模型全部造模成功。生物節(jié)律固定下來的活動稱為習(xí)慣性行為，維持習(xí)慣性行為功能的負反饋機制會抑制非靶組織細胞以及其他信號轉(zhuǎn)導(dǎo)通路的激活[20-21]。靶組織細胞通過分泌細胞因子或外泌體在盡可能多的細胞中激活特異信號轉(zhuǎn)導(dǎo)通路，通過抑制相應(yīng)的功能將它們的能量消耗節(jié)省下來維持效率更高的習(xí)慣性行為[20-21]。有研究表明，人類長期不良生活方式可能是影響高尿酸血癥的主要原因[13]。不良的飲食習(xí)慣（食用紅肉、海鮮、魚類、果糖、含糖軟飲料和酒精飲料）和運動不足都會增加偶發(fā)性高尿酸血癥的風(fēng)險[22]。因此，從習(xí)慣性行為角度更改不良的生活方式可能是扭轉(zhuǎn)日趨嚴重的高尿酸血癥發(fā)生的關(guān)鍵環(huán)節(jié)。

綜上所述，為期4 周的氧嗪酸鉀、腺嘌呤和酵母膏藥物處理均可以建立穩(wěn)定的高尿酸血癥的動物模型。氧嗪酸鉀聯(lián)合腺嘌呤對高尿酸血癥的作用尤其突出。本研究模型的建立對高尿酸血癥藥物的篩選與開發(fā)以及對非藥物干預(yù)治療有重要的意義。