滋癸益經湯治療卵巢早衰作用機制的網絡藥理學研究

楊益雯， 田海艷， 羅頌平， 趙穎

（1.廣州中醫藥大學第一臨床醫學院，廣東廣州 510405；2.廣州中醫藥大學第一附屬醫院婦科，廣東廣州 510405）

卵巢早衰（premature ovarian failure）是指女性40 歲以前出現閉經、促性腺激素水平升高（FSH＞40 U/L）和雌激素水平降低，并伴有潮熱、盜汗、陰道干澀等圍絕經期癥狀，是早發性卵巢功能不全（POI）的終末階段[1]。據統計，卵巢早衰的發病率約為1%，并呈逐年上升的趨勢[2]。目前，POI診療指南推薦的治療方法主要為激素補充治療（HRT）[3]，該法可改善患者的臨床表現，但在幫助卵巢早衰患者生育方面暫無有效方法，且即使使用最接近天然的激素，也可能提高乳腺癌的發生率[4]。卵泡體外激活雖有妊娠的案例但成功率低[5]。其他治療方法如免疫、干細胞、基因編輯等尚在研究階段[3]。相比之下，中醫藥治療卵巢早衰取得了不錯的療效，且副作用小，具有一定優勢。

張玉珍教授為婦科名家，是嶺南羅氏婦科代表性傳承人，其團隊在國內以中醫藥防治卵巢早衰處于領先地位。她認為，卵巢早衰病機以腎虛為主，累及心、肝、脾多臟，擬定專病專方滋癸益經湯[6]。該方由菟絲子、枸杞子、人參、淫羊藿、熟地黃、丹參、柴胡、炙甘草8 味中藥組成，臨床與實驗研究證明，該方可降低患者的促性腺激素（FSH）和促卵泡生成素（LH）的水平，提高雌二醇（E2）和抗苗勒氏管激素（AMH）的水平，改善卵巢血供，增加子宮內膜厚度[7-8]，還可改善卵巢儲備功能，可通過增強自身免疫性POI小鼠卵巢抑制素B 的信使RNA 表達來提高抑制素B 的濃度[7]；但其主要活性成分及作用機制尚不完全明確。本研究采用中藥網絡藥理學方法，以“網絡靶向多組分”為主要研究模式，通過檢索在線數據庫構建“疾病-基因-靶點-藥物”網絡，通過數據挖掘藥物對多種信號通路的調節作用預測藥物活性成分、體內作用靶點、作用機制等[9]，探討該方治療卵巢早衰的作用機制，現將研究結果報道如下。

1 資料與方法

1.1 獲取滋癸益經湯活性成分及靶標 以口服生物利用度（OB）≥30%和類藥性（DL）≥0.18為篩選標準，在中藥系統藥理學分析平臺（TCMSP）數據庫中對方中組成中藥菟絲子、枸杞子、人參、淫羊藿、熟地黃、丹參、柴胡（TCMSP數據庫中未收錄炙甘草，故本研究未納入）進行檢索，獲得該方活性成分，并根據活性成分查找得到對應的靶標蛋白。

1.2 搜集卵巢早衰靶標 分別通過在線文本挖掘服務器GeneCards（https://www.genecards.org/）和在線人類孟德爾遺傳（OMIM）數據庫（https://omim.org/），以“premature ovarian failure”和“POF”為關鍵詞檢索卵巢早衰的相關靶點，建立卵巢早衰疾病靶點數據集。

1.3 搜集滋癸益經湯作用于卵巢早衰的靶點 查詢UniProt 數據庫（https：//www.uniprot.org/），為該方活性成分對應靶標添加簡稱。利用R 4.0.2 軟件對該方活性成分作用的靶標和卵巢早衰相關的靶標取交集，獲得潛在作用靶點，并繪制交集圖。

1.4 構建“活性成分-作用靶點”關系網絡 將滋癸益經湯的活性成分、潛在作用靶點作用關系導入Cytoscape 3.7.2 軟件，得到“活性成分-作用靶點”網絡。

1.5 構建蛋白質-蛋白質相互作用（PPI）網絡 將潛在作用靶點導入STRING（https://string-db.org/）數據庫中，以置信度分數（Score）≥0.900（高置信度）為條件進行篩選，去除沒有聯系的節點，得到作用靶點蛋白之間相互作用網絡，獲得PPI 網絡關系圖和文件。利用R 4.0.2 軟件篩選出連線最多的前20 位的靶點，繪制柱狀圖。將前10 位靶點相互作用關系導入Cytoscape 3.7.2 軟件，得到它們之間的相互作用網絡。

1.6 基因富集分析 利用David 6.8數據庫（https：//david.ncifcrf.gov）對潛在作用靶點進行基因本體論（GO）和京都基因與基因組百科全書（KEGG）分析，探討滋癸益經湯治療卵巢早衰可能的生物學功能和主要的信號通路。本研究以P＜0.05為篩選條件，分別選取富集結果的前20 條GO 生物功能和KEGG 信號通路，利用R 4.0.2軟件進行可視化。

1.7 構建“潛在靶標-KEGG 通路”關系網絡 查閱相關文獻，從KEGG 富集的前20 條通路中篩選可能與卵巢早衰有關的通路，將其與靶標關系文件導入Cytoscape 3.7.2 軟件，進一步得到“潛在靶點-KEGG 通路”關系網絡圖。

2 結果

2.1 滋癸益經湯的活性成分及其靶標 通過TCMSP平臺，篩選得到菟絲子的活性成分有11 種、人參22 種、枸杞子45 種、熟地黃2 種、淫羊藿23 種、柴胡17種、丹參65種。剔除重復部分后，該方得到167 種活性成分，將其活性成分輸入TCMSP 平臺檢索并刪除重復靶標后，得到278個靶標。檢索UniProt數據庫，為靶標添加簡稱。

2.2 卵巢早衰的靶標 按“1.2”項方法檢索并刪除重復靶標后，獲得卵巢早衰相關的靶標997個。

2. 3 滋癸益經湯治療卵巢早衰的潛在靶點 按“1.3”項的方法對“2.1”項和“2.2”項的靶標取交集，得到69 個滋癸益經湯治療卵巢早衰的潛在作用靶點，見圖1。

圖1 滋癸益經湯治療卵巢早衰潛在靶點的韋恩圖Figure 1 Venn diagram of potential targets of Zigui Yijing Decoction for treatment of POF

2.4 “成分-靶標”網絡的構建 將編排后的滋癸益經湯的278 個活性成分、治療卵巢早衰的69 個潛在靶點導入Cytoscape 3.7.2 軟件可視化，獲得“滋癸益經湯活性成分-卵巢早衰潛在靶點”關系網絡，見圖2。其中，黃色部分代表滋癸益經湯組成中藥，藍色代表中藥的活性成分，綠色部分代表卵巢早衰潛在靶點。網絡中活性成分與潛在靶點連線越多，即度（Degree）值越高，與卵巢早衰治療的相關性越大，Degree 值前10 位的活性成分如表1所示。

表1 滋癸益經湯活性成分[度（Degree）值前10 位]Table 1 Active ingredients of Zigui Yijing Decoction（top 10 in Degree value）

圖2 “滋癸益經湯活性成分-卵巢早衰潛在靶點”關系網絡Figure 2 Relationship network of“active ingredients of Zigui Yijing Decoction-potential targets of POF”

2.5 蛋白質-蛋白質相互作用網絡的構建及拓撲結構的分析 將滋癸益經湯治療卵巢早衰的69 個潛在靶點錄入STRING 數據庫，獲得蛋白質-蛋白質相互作用的關系網絡圖，結果如圖3。其中，AKT1、TP53、VEGFA、IL6、TNF 位于核心基因位置。結果如圖3～5。

圖3 滋癸益經湯治療卵巢早衰的蛋白質-蛋白質相互作用網絡Figure 3 Protein-protein interaction network of Zigui Yijing Decoction in the treatment of POF

圖4 度（Degree）值排名前20位的滋癸益經湯治療卵巢早衰靶點Figure 4 The top 20 targets of Zigui Yijing Decoction in the treatment of POF in Degree value

圖5 滋癸益經湯治療卵巢早衰前10 位潛在靶標的互作網絡圖Figure 5 Interaction network of the top 10 potential targets of Zigui Yijing Decoction in the treatment of POF

2.6 GO 功能和KEGG 通路富集分析 利用David在線數據庫，將69個潛在靶點進行GO和KEGG分析。得到GO分子功能富集條目74個。根據P值從小到大的順序，選取前20 個分析條目進行可視化，以條形的長度代表相應條目所富集基因數。結果顯示，這69 個潛在靶點的分子功能主要富集在類固醇結合、氧化還原酶活性、細胞因子活性等方面。結果如圖6所示。

圖6 GO分子功能富集分析結果Figure 6 Analysis results of GO molecular function enrichment

共富集127條KEGG信號通路，去除與其他器官癌癥相關的通路，按照P值從小到大的順序篩選前20條，主要包括：缺氧誘導因子1（HIF-1）信號通路、叉頭盒O（FoxO）信號通路、p53 信號通路、磷脂酰肌醇3激酶-蛋白激酶B（PI3K/Akt）信號通路等。結果如圖7所示。

圖7 KEGG 通路富集分析結果Figure 7 Enrichment analysis results of KEGG pathways

2.7 構建KEGG通路關系網絡 將富集的前20條KEGG 通路關系文件導入Cytoscape 3.7.2 軟件，構建“潛在靶點-KEGG 通路”關系網絡圖，并計算KEGG 通路和潛在靶點的Degree值。其中，橙色部分代表KEGG通路，橙色節點為通路上富集的潛在靶點，藍色節點代表靶標參與的通路。根據KEGG關系網絡，篩選出節點連接Degree 值排名前20 位的靶標。這些靶標是網絡中連接度最大、最重要的靶標。其中，IL6、AKT1、TGFB1、TNF等13個靶標也是蛋白質-蛋白質相互作用網絡關系網絡中的核心基因。查閱相關文獻，得出槲皮素、木犀草素、山柰酚是治療卵巢早衰的主要潛在活性成分。這些活性成分的核心作用靶標中，IL6、AKT、IL10、IL2、TP53、MYC、第10 號染色體缺失的磷酸酶及張力蛋白同源基因（PTEN）這7 個靶標同時也是PI3K/Akt、HIF-1、p53、FoxO 這幾個與卵巢早衰密切相關的信號通路中的靶點蛋白，以此構建“藥物-活性成分-潛在靶點-KEGG 通路”關系網絡圖。結果見圖8～9、表2。

圖8 “潛在靶點-KEGG 通路”關系網絡圖Figure 8 Network diagram of“potential targets-KEGG pathways”

圖9 “藥物-活性成分-潛在靶點-KEGG 通路”關系網絡圖Figure 9 Network diagram of“drugs-active ingredients-potential targets-KEGG pathways”

表2 KEGG關系網絡連接度（Degree）值前20位的靶標Table 2 The targets in the top 20 Degree values in KEGG relational network

3 討論

張玉珍教授認為，卵巢早衰是因臟腑、氣血、天癸、沖任、胞宮先后受病，導致脾腎兩虛、肝氣郁滯、血枯瘀阻，逐漸致天癸、沖任衰少，血海空虛，胞宮失于濡養而發病[10]，治療需補腎健脾、調肝活血，以此創立治療卵巢早衰的專方滋癸益經湯。方中菟絲子和人參同為君藥，養肝血填腎精，大補脾肺之氣；枸杞子滋肝補腎，熟地黃補血養陰，淫羊藿溫腎壯陽，三者共為臣藥；柴胡、丹參疏肝活血為佐；炙甘草調和諸藥為使。該方效果良好，但是其療效機制尚不明確。本研究借助在線數據庫共篩選得到滋癸益經湯活性成分167種，藥物靶點基因278個，與疾病的交集基因69 個，篩選得到與治療卵巢早衰有關的潛在活性成分130種，其中，部分化合物的有效性及作用機制已被證實。

從“藥物-活性成分-潛在靶點-KEGG 通路”關系網絡圖中分析，該方中菟絲子等7味中藥富含的槲皮素、木犀草素、山柰酚3種生物類黃酮，可能是該方的主要有效成分。這些生物類黃酮可直接作用于Akt。槲皮素和木犀草素還可以通過作用于白細胞介素10（IL-10）、白細胞介素2（IL-2）2 種細胞因子及第10 號染色體缺失的磷酸酶及張力蛋白同源基因（PTEN）間接作用于Akt。結合信號通路圖和相關文獻研究發現，Akt 可以通過PI3K/Akt信號通路磷酸化下游靶點因子誘導血管生成來增加卵巢內血供，從而恢復卵巢功能[11]，故推測這可能是滋癸益經湯改善卵巢血供的作用機制。

滋癸益經湯改善卵巢早衰患者激素水平的機制較為復雜，涉及多個有效成分和信號通路。已知HIF-1、p53、FoxO 信號通路是PI3K/Akt 信號通路的下游信號通路，均由靶激酶Akt磷酸化下游靶點因子發揮作用[12]。HIF-1信號通路負責調節氧穩態，當HIF-1 信號通路被激活時，氧氣輸送增加，消耗減少，可在缺氧和常氧條件下不同程度地調節包括卵泡細胞在內的各種組織細胞增殖[13]。p53信號通路是細胞衰老和凋亡中的一環，當通路中的腫瘤抑制因子p53 蛋白（TP53）因DNA 損傷、低氧和癌基因激活等應激信號激活時，細胞周期停滯，細胞走向凋亡[14]，Akt可以通過磷酸化TP53的上游靶點抑制TP53 的功能。但也有研究提出相反結論[15]。FoxO 信號通路中FoxO3a 是卵泡激活的關鍵調節因子，由Akt磷酸化激活，可抑制原始卵泡的過早及過度激活，保持卵巢中的卵泡儲備，FoxO3a 功能異常的小鼠的原始卵泡在性成熟前整體激活，從而使卵巢過早衰竭[16]。PI3K/Akt信號通路中的PTEN也有抑制原始卵泡激活的作用，維持卵巢中的卵泡儲備[17]。滋癸益經湯可能通過以上通路和靶點調節卵巢組織細胞增殖、抑制凋亡、抑制原始卵泡過早激活來改善卵巢早衰患者體內性激素和AMH 的水平。動物實驗也印證了槲皮素、木犀草素、山柰酚對FSH、LH、E2、AMH水平的正面影響以及對卵巢細胞增殖和原始卵泡情況的改善[18-21]。

另外，槲皮素的作用靶點MYC 亦是PI3K/Akt信號通路中的下游靶點，與細胞周期相關，值得進一步探討。

GO 富集分析結果表明，滋癸益經湯治療卵巢早衰的生物學過程主要體現在氧化還原酶活性、類固醇結合、細胞因子活性上。氧化應激會使卵巢顆粒細胞的蛋白質、DNA 等氧化損傷，最終導致細胞凋亡，故抑制氧化應激過程可以保護卵巢細胞[22]。類固醇結合蛋白（SHBG）可以與性激素特異性結合并轉運，當其編碼基因出現問題導致SHBG功能減弱時，雄激素活性降低，卵泡生長失調，引起卵巢早衰[23]。以此推斷，提高類固醇結合性或許可以改善卵巢早衰。參與卵巢早衰的細胞因子主要包括TNF-α 和INF-γ 等，降低這些細胞因子的表達水平，可有效抑制卵巢顆粒細胞凋亡，從而使卵巢功能得到恢復[24-26]。本研究GO 富集分析的結果與文獻報道基本一致，據此推斷，滋癸益經湯治療卵巢早衰涉及氧化還原酶活性、類固醇結合、細胞因子活性等多種復雜的生物過程。

綜上所述，滋癸益經湯治療卵巢早衰的作用機制涉及多個活性成分、作用靶點及生物通路。槲皮素、木犀草素、山柰酚等是滋癸益經湯中治療卵巢早衰的主要活性成分，它們通過作用于IL6、AKT1、PTEN 等靶標蛋白，影響PI3K/Akt、HIF-1、FoxO、p53 信號通路，從而治療卵巢早衰。滋癸益經湯治療卵巢早衰的作用機制可能還與抗氧化應激、原始卵泡激活、細胞增殖和凋亡等途徑相關，需進一步通過實驗驗證。