滋癸益經(jīng)湯治療卵巢早衰作用機(jī)制的網(wǎng)絡(luò)藥理學(xué)研究

楊益雯， 田海艷， 羅頌平， 趙穎

（1.廣州中醫(yī)藥大學(xué)第一臨床醫(yī)學(xué)院，廣東廣州 510405；2.廣州中醫(yī)藥大學(xué)第一附屬醫(yī)院婦科，廣東廣州 510405）

卵巢早衰（premature ovarian failure）是指女性40 歲以前出現(xiàn)閉經(jīng)、促性腺激素水平升高（FSH＞40 U/L）和雌激素水平降低，并伴有潮熱、盜汗、陰道干澀等圍絕經(jīng)期癥狀，是早發(fā)性卵巢功能不全（POI）的終末階段[1]。據(jù)統(tǒng)計(jì)，卵巢早衰的發(fā)病率約為1%，并呈逐年上升的趨勢(shì)[2]。目前，POI診療指南推薦的治療方法主要為激素補(bǔ)充治療（HRT）[3]，該法可改善患者的臨床表現(xiàn)，但在幫助卵巢早衰患者生育方面暫無(wú)有效方法，且即使使用最接近天然的激素，也可能提高乳腺癌的發(fā)生率[4]。卵泡體外激活雖有妊娠的案例但成功率低[5]。其他治療方法如免疫、干細(xì)胞、基因編輯等尚在研究階段[3]。相比之下，中醫(yī)藥治療卵巢早衰取得了不錯(cuò)的療效，且副作用小，具有一定優(yōu)勢(shì)。

張玉珍教授為婦科名家，是嶺南羅氏婦科代表性傳承人，其團(tuán)隊(duì)在國(guó)內(nèi)以中醫(yī)藥防治卵巢早衰處于領(lǐng)先地位。她認(rèn)為，卵巢早衰病機(jī)以腎虛為主，累及心、肝、脾多臟，擬定專(zhuān)病專(zhuān)方滋癸益經(jīng)湯[6]。該方由菟絲子、枸杞子、人參、淫羊藿、熟地黃、丹參、柴胡、炙甘草8 味中藥組成，臨床與實(shí)驗(yàn)研究證明，該方可降低患者的促性腺激素（FSH）和促卵泡生成素（LH）的水平，提高雌二醇（E2）和抗苗勒氏管激素（AMH）的水平，改善卵巢血供，增加子宮內(nèi)膜厚度[7-8]，還可改善卵巢儲(chǔ)備功能，可通過(guò)增強(qiáng)自身免疫性POI小鼠卵巢抑制素B 的信使RNA 表達(dá)來(lái)提高抑制素B 的濃度[7]；但其主要活性成分及作用機(jī)制尚不完全明確。本研究采用中藥網(wǎng)絡(luò)藥理學(xué)方法，以“網(wǎng)絡(luò)靶向多組分”為主要研究模式，通過(guò)檢索在線數(shù)據(jù)庫(kù)構(gòu)建“疾病-基因-靶點(diǎn)-藥物”網(wǎng)絡(luò)，通過(guò)數(shù)據(jù)挖掘藥物對(duì)多種信號(hào)通路的調(diào)節(jié)作用預(yù)測(cè)藥物活性成分、體內(nèi)作用靶點(diǎn)、作用機(jī)制等[9]，探討該方治療卵巢早衰的作用機(jī)制，現(xiàn)將研究結(jié)果報(bào)道如下。

1 資料與方法

1.1 獲取滋癸益經(jīng)湯活性成分及靶標(biāo) 以口服生物利用度（OB）≥30%和類(lèi)藥性（DL）≥0.18為篩選標(biāo)準(zhǔn)，在中藥系統(tǒng)藥理學(xué)分析平臺(tái)（TCMSP）數(shù)據(jù)庫(kù)中對(duì)方中組成中藥菟絲子、枸杞子、人參、淫羊藿、熟地黃、丹參、柴胡（TCMSP數(shù)據(jù)庫(kù)中未收錄炙甘草，故本研究未納入）進(jìn)行檢索，獲得該方活性成分，并根據(jù)活性成分查找得到對(duì)應(yīng)的靶標(biāo)蛋白。

1.2 搜集卵巢早衰靶標(biāo) 分別通過(guò)在線文本挖掘服務(wù)器GeneCards（https://www.genecards.org/）和在線人類(lèi)孟德?tīng)栠z傳（OMIM）數(shù)據(jù)庫(kù)（https://omim.org/），以“premature ovarian failure”和“POF”為關(guān)鍵詞檢索卵巢早衰的相關(guān)靶點(diǎn)，建立卵巢早衰疾病靶點(diǎn)數(shù)據(jù)集。

1.3 搜集滋癸益經(jīng)湯作用于卵巢早衰的靶點(diǎn) 查詢(xún)UniProt 數(shù)據(jù)庫(kù)（https：//www.uniprot.org/），為該方活性成分對(duì)應(yīng)靶標(biāo)添加簡(jiǎn)稱(chēng)。利用R 4.0.2 軟件對(duì)該方活性成分作用的靶標(biāo)和卵巢早衰相關(guān)的靶標(biāo)取交集，獲得潛在作用靶點(diǎn)，并繪制交集圖。

1.4 構(gòu)建“活性成分-作用靶點(diǎn)”關(guān)系網(wǎng)絡(luò) 將滋癸益經(jīng)湯的活性成分、潛在作用靶點(diǎn)作用關(guān)系導(dǎo)入Cytoscape 3.7.2 軟件，得到“活性成分-作用靶點(diǎn)”網(wǎng)絡(luò)。

1.5 構(gòu)建蛋白質(zhì)-蛋白質(zhì)相互作用（PPI）網(wǎng)絡(luò) 將潛在作用靶點(diǎn)導(dǎo)入STRING（https://string-db.org/）數(shù)據(jù)庫(kù)中，以置信度分?jǐn)?shù)（Score）≥0.900（高置信度）為條件進(jìn)行篩選，去除沒(méi)有聯(lián)系的節(jié)點(diǎn)，得到作用靶點(diǎn)蛋白之間相互作用網(wǎng)絡(luò)，獲得PPI 網(wǎng)絡(luò)關(guān)系圖和文件。利用R 4.0.2 軟件篩選出連線最多的前20 位的靶點(diǎn)，繪制柱狀圖。將前10 位靶點(diǎn)相互作用關(guān)系導(dǎo)入Cytoscape 3.7.2 軟件，得到它們之間的相互作用網(wǎng)絡(luò)。

1.6 基因富集分析 利用David 6.8數(shù)據(jù)庫(kù)（https：//david.ncifcrf.gov）對(duì)潛在作用靶點(diǎn)進(jìn)行基因本體論（GO）和京都基因與基因組百科全書(shū)（KEGG）分析，探討滋癸益經(jīng)湯治療卵巢早衰可能的生物學(xué)功能和主要的信號(hào)通路。本研究以P＜0.05為篩選條件，分別選取富集結(jié)果的前20 條GO 生物功能和KEGG 信號(hào)通路，利用R 4.0.2軟件進(jìn)行可視化。

1.7 構(gòu)建“潛在靶標(biāo)-KEGG 通路”關(guān)系網(wǎng)絡(luò) 查閱相關(guān)文獻(xiàn)，從KEGG 富集的前20 條通路中篩選可能與卵巢早衰有關(guān)的通路，將其與靶標(biāo)關(guān)系文件導(dǎo)入Cytoscape 3.7.2 軟件，進(jìn)一步得到“潛在靶點(diǎn)-KEGG 通路”關(guān)系網(wǎng)絡(luò)圖。

2 結(jié)果

2.1 滋癸益經(jīng)湯的活性成分及其靶標(biāo) 通過(guò)TCMSP平臺(tái)，篩選得到菟絲子的活性成分有11 種、人參22 種、枸杞子45 種、熟地黃2 種、淫羊藿23 種、柴胡17種、丹參65種。剔除重復(fù)部分后，該方得到167 種活性成分，將其活性成分輸入TCMSP 平臺(tái)檢索并刪除重復(fù)靶標(biāo)后，得到278個(gè)靶標(biāo)。檢索UniProt數(shù)據(jù)庫(kù)，為靶標(biāo)添加簡(jiǎn)稱(chēng)。

2.2 卵巢早衰的靶標(biāo) 按“1.2”項(xiàng)方法檢索并刪除重復(fù)靶標(biāo)后，獲得卵巢早衰相關(guān)的靶標(biāo)997個(gè)。

2. 3 滋癸益經(jīng)湯治療卵巢早衰的潛在靶點(diǎn) 按“1.3”項(xiàng)的方法對(duì)“2.1”項(xiàng)和“2.2”項(xiàng)的靶標(biāo)取交集，得到69 個(gè)滋癸益經(jīng)湯治療卵巢早衰的潛在作用靶點(diǎn)，見(jiàn)圖1。

圖1 滋癸益經(jīng)湯治療卵巢早衰潛在靶點(diǎn)的韋恩圖Figure 1 Venn diagram of potential targets of Zigui Yijing Decoction for treatment of POF

2.4 “成分-靶標(biāo)”網(wǎng)絡(luò)的構(gòu)建 將編排后的滋癸益經(jīng)湯的278 個(gè)活性成分、治療卵巢早衰的69 個(gè)潛在靶點(diǎn)導(dǎo)入Cytoscape 3.7.2 軟件可視化，獲得“滋癸益經(jīng)湯活性成分-卵巢早衰潛在靶點(diǎn)”關(guān)系網(wǎng)絡(luò)，見(jiàn)圖2。其中，黃色部分代表滋癸益經(jīng)湯組成中藥，藍(lán)色代表中藥的活性成分，綠色部分代表卵巢早衰潛在靶點(diǎn)。網(wǎng)絡(luò)中活性成分與潛在靶點(diǎn)連線越多，即度（Degree）值越高，與卵巢早衰治療的相關(guān)性越大，Degree 值前10 位的活性成分如表1所示。

表1 滋癸益經(jīng)湯活性成分[度（Degree）值前10 位]Table 1 Active ingredients of Zigui Yijing Decoction（top 10 in Degree value）

圖2 “滋癸益經(jīng)湯活性成分-卵巢早衰潛在靶點(diǎn)”關(guān)系網(wǎng)絡(luò)Figure 2 Relationship network of“active ingredients of Zigui Yijing Decoction-potential targets of POF”

2.5 蛋白質(zhì)-蛋白質(zhì)相互作用網(wǎng)絡(luò)的構(gòu)建及拓?fù)浣Y(jié)構(gòu)的分析 將滋癸益經(jīng)湯治療卵巢早衰的69 個(gè)潛在靶點(diǎn)錄入STRING 數(shù)據(jù)庫(kù)，獲得蛋白質(zhì)-蛋白質(zhì)相互作用的關(guān)系網(wǎng)絡(luò)圖，結(jié)果如圖3。其中，AKT1、TP53、VEGFA、IL6、TNF 位于核心基因位置。結(jié)果如圖3～5。

圖3 滋癸益經(jīng)湯治療卵巢早衰的蛋白質(zhì)-蛋白質(zhì)相互作用網(wǎng)絡(luò)Figure 3 Protein-protein interaction network of Zigui Yijing Decoction in the treatment of POF

圖4 度（Degree）值排名前20位的滋癸益經(jīng)湯治療卵巢早衰靶點(diǎn)Figure 4 The top 20 targets of Zigui Yijing Decoction in the treatment of POF in Degree value

圖5 滋癸益經(jīng)湯治療卵巢早衰前10 位潛在靶標(biāo)的互作網(wǎng)絡(luò)圖Figure 5 Interaction network of the top 10 potential targets of Zigui Yijing Decoction in the treatment of POF

2.6 GO 功能和KEGG 通路富集分析 利用David在線數(shù)據(jù)庫(kù)，將69個(gè)潛在靶點(diǎn)進(jìn)行GO和KEGG分析。得到GO分子功能富集條目74個(gè)。根據(jù)P值從小到大的順序，選取前20 個(gè)分析條目進(jìn)行可視化，以條形的長(zhǎng)度代表相應(yīng)條目所富集基因數(shù)。結(jié)果顯示，這69 個(gè)潛在靶點(diǎn)的分子功能主要富集在類(lèi)固醇結(jié)合、氧化還原酶活性、細(xì)胞因子活性等方面。結(jié)果如圖6所示。

圖6 GO分子功能富集分析結(jié)果Figure 6 Analysis results of GO molecular function enrichment

共富集127條KEGG信號(hào)通路，去除與其他器官癌癥相關(guān)的通路，按照P值從小到大的順序篩選前20條，主要包括：缺氧誘導(dǎo)因子1（HIF-1）信號(hào)通路、叉頭盒O（FoxO）信號(hào)通路、p53 信號(hào)通路、磷脂酰肌醇3激酶-蛋白激酶B（PI3K/Akt）信號(hào)通路等。結(jié)果如圖7所示。

圖7 KEGG 通路富集分析結(jié)果Figure 7 Enrichment analysis results of KEGG pathways

2.7 構(gòu)建KEGG通路關(guān)系網(wǎng)絡(luò) 將富集的前20條KEGG 通路關(guān)系文件導(dǎo)入Cytoscape 3.7.2 軟件，構(gòu)建“潛在靶點(diǎn)-KEGG 通路”關(guān)系網(wǎng)絡(luò)圖，并計(jì)算KEGG 通路和潛在靶點(diǎn)的Degree值。其中，橙色部分代表KEGG通路，橙色節(jié)點(diǎn)為通路上富集的潛在靶點(diǎn)，藍(lán)色節(jié)點(diǎn)代表靶標(biāo)參與的通路。根據(jù)KEGG關(guān)系網(wǎng)絡(luò)，篩選出節(jié)點(diǎn)連接Degree 值排名前20 位的靶標(biāo)。這些靶標(biāo)是網(wǎng)絡(luò)中連接度最大、最重要的靶標(biāo)。其中，IL6、AKT1、TGFB1、TNF等13個(gè)靶標(biāo)也是蛋白質(zhì)-蛋白質(zhì)相互作用網(wǎng)絡(luò)關(guān)系網(wǎng)絡(luò)中的核心基因。查閱相關(guān)文獻(xiàn)，得出槲皮素、木犀草素、山柰酚是治療卵巢早衰的主要潛在活性成分。這些活性成分的核心作用靶標(biāo)中，IL6、AKT、IL10、IL2、TP53、MYC、第10 號(hào)染色體缺失的磷酸酶及張力蛋白同源基因（PTEN）這7 個(gè)靶標(biāo)同時(shí)也是PI3K/Akt、HIF-1、p53、FoxO 這幾個(gè)與卵巢早衰密切相關(guān)的信號(hào)通路中的靶點(diǎn)蛋白，以此構(gòu)建“藥物-活性成分-潛在靶點(diǎn)-KEGG 通路”關(guān)系網(wǎng)絡(luò)圖。結(jié)果見(jiàn)圖8～9、表2。

圖8 “潛在靶點(diǎn)-KEGG 通路”關(guān)系網(wǎng)絡(luò)圖Figure 8 Network diagram of“potential targets-KEGG pathways”

圖9 “藥物-活性成分-潛在靶點(diǎn)-KEGG 通路”關(guān)系網(wǎng)絡(luò)圖Figure 9 Network diagram of“drugs-active ingredients-potential targets-KEGG pathways”

表2 KEGG關(guān)系網(wǎng)絡(luò)連接度（Degree）值前20位的靶標(biāo)Table 2 The targets in the top 20 Degree values in KEGG relational network

3 討論

張玉珍教授認(rèn)為，卵巢早衰是因臟腑、氣血、天癸、沖任、胞宮先后受病，導(dǎo)致脾腎兩虛、肝氣郁滯、血枯瘀阻，逐漸致天癸、沖任衰少，血海空虛，胞宮失于濡養(yǎng)而發(fā)病[10]，治療需補(bǔ)腎健脾、調(diào)肝活血，以此創(chuàng)立治療卵巢早衰的專(zhuān)方滋癸益經(jīng)湯。方中菟絲子和人參同為君藥，養(yǎng)肝血填腎精，大補(bǔ)脾肺之氣；枸杞子滋肝補(bǔ)腎，熟地黃補(bǔ)血養(yǎng)陰，淫羊藿溫腎壯陽(yáng)，三者共為臣藥；柴胡、丹參疏肝活血為佐；炙甘草調(diào)和諸藥為使。該方效果良好，但是其療效機(jī)制尚不明確。本研究借助在線數(shù)據(jù)庫(kù)共篩選得到滋癸益經(jīng)湯活性成分167種，藥物靶點(diǎn)基因278個(gè)，與疾病的交集基因69 個(gè)，篩選得到與治療卵巢早衰有關(guān)的潛在活性成分130種，其中，部分化合物的有效性及作用機(jī)制已被證實(shí)。

從“藥物-活性成分-潛在靶點(diǎn)-KEGG 通路”關(guān)系網(wǎng)絡(luò)圖中分析，該方中菟絲子等7味中藥富含的槲皮素、木犀草素、山柰酚3種生物類(lèi)黃酮，可能是該方的主要有效成分。這些生物類(lèi)黃酮可直接作用于Akt。槲皮素和木犀草素還可以通過(guò)作用于白細(xì)胞介素10（IL-10）、白細(xì)胞介素2（IL-2）2 種細(xì)胞因子及第10 號(hào)染色體缺失的磷酸酶及張力蛋白同源基因（PTEN）間接作用于Akt。結(jié)合信號(hào)通路圖和相關(guān)文獻(xiàn)研究發(fā)現(xiàn)，Akt 可以通過(guò)PI3K/Akt信號(hào)通路磷酸化下游靶點(diǎn)因子誘導(dǎo)血管生成來(lái)增加卵巢內(nèi)血供，從而恢復(fù)卵巢功能[11]，故推測(cè)這可能是滋癸益經(jīng)湯改善卵巢血供的作用機(jī)制。

滋癸益經(jīng)湯改善卵巢早衰患者激素水平的機(jī)制較為復(fù)雜，涉及多個(gè)有效成分和信號(hào)通路。已知HIF-1、p53、FoxO 信號(hào)通路是PI3K/Akt 信號(hào)通路的下游信號(hào)通路，均由靶激酶Akt磷酸化下游靶點(diǎn)因子發(fā)揮作用[12]。HIF-1信號(hào)通路負(fù)責(zé)調(diào)節(jié)氧穩(wěn)態(tài)，當(dāng)HIF-1 信號(hào)通路被激活時(shí)，氧氣輸送增加，消耗減少，可在缺氧和常氧條件下不同程度地調(diào)節(jié)包括卵泡細(xì)胞在內(nèi)的各種組織細(xì)胞增殖[13]。p53信號(hào)通路是細(xì)胞衰老和凋亡中的一環(huán)，當(dāng)通路中的腫瘤抑制因子p53 蛋白（TP53）因DNA 損傷、低氧和癌基因激活等應(yīng)激信號(hào)激活時(shí)，細(xì)胞周期停滯，細(xì)胞走向凋亡[14]，Akt可以通過(guò)磷酸化TP53的上游靶點(diǎn)抑制TP53 的功能。但也有研究提出相反結(jié)論[15]。FoxO 信號(hào)通路中FoxO3a 是卵泡激活的關(guān)鍵調(diào)節(jié)因子，由Akt磷酸化激活，可抑制原始卵泡的過(guò)早及過(guò)度激活，保持卵巢中的卵泡儲(chǔ)備，F(xiàn)oxO3a 功能異常的小鼠的原始卵泡在性成熟前整體激活，從而使卵巢過(guò)早衰竭[16]。PI3K/Akt信號(hào)通路中的PTEN也有抑制原始卵泡激活的作用，維持卵巢中的卵泡儲(chǔ)備[17]。滋癸益經(jīng)湯可能通過(guò)以上通路和靶點(diǎn)調(diào)節(jié)卵巢組織細(xì)胞增殖、抑制凋亡、抑制原始卵泡過(guò)早激活來(lái)改善卵巢早衰患者體內(nèi)性激素和AMH 的水平。動(dòng)物實(shí)驗(yàn)也印證了槲皮素、木犀草素、山柰酚對(duì)FSH、LH、E2、AMH水平的正面影響以及對(duì)卵巢細(xì)胞增殖和原始卵泡情況的改善[18-21]。

另外，槲皮素的作用靶點(diǎn)MYC 亦是PI3K/Akt信號(hào)通路中的下游靶點(diǎn)，與細(xì)胞周期相關(guān)，值得進(jìn)一步探討。

GO 富集分析結(jié)果表明，滋癸益經(jīng)湯治療卵巢早衰的生物學(xué)過(guò)程主要體現(xiàn)在氧化還原酶活性、類(lèi)固醇結(jié)合、細(xì)胞因子活性上。氧化應(yīng)激會(huì)使卵巢顆粒細(xì)胞的蛋白質(zhì)、DNA 等氧化損傷，最終導(dǎo)致細(xì)胞凋亡，故抑制氧化應(yīng)激過(guò)程可以保護(hù)卵巢細(xì)胞[22]。類(lèi)固醇結(jié)合蛋白（SHBG）可以與性激素特異性結(jié)合并轉(zhuǎn)運(yùn)，當(dāng)其編碼基因出現(xiàn)問(wèn)題導(dǎo)致SHBG功能減弱時(shí)，雄激素活性降低，卵泡生長(zhǎng)失調(diào)，引起卵巢早衰[23]。以此推斷，提高類(lèi)固醇結(jié)合性或許可以改善卵巢早衰。參與卵巢早衰的細(xì)胞因子主要包括TNF-α 和INF-γ 等，降低這些細(xì)胞因子的表達(dá)水平，可有效抑制卵巢顆粒細(xì)胞凋亡，從而使卵巢功能得到恢復(fù)[24-26]。本研究GO 富集分析的結(jié)果與文獻(xiàn)報(bào)道基本一致，據(jù)此推斷，滋癸益經(jīng)湯治療卵巢早衰涉及氧化還原酶活性、類(lèi)固醇結(jié)合、細(xì)胞因子活性等多種復(fù)雜的生物過(guò)程。

綜上所述，滋癸益經(jīng)湯治療卵巢早衰的作用機(jī)制涉及多個(gè)活性成分、作用靶點(diǎn)及生物通路。槲皮素、木犀草素、山柰酚等是滋癸益經(jīng)湯中治療卵巢早衰的主要活性成分，它們通過(guò)作用于IL6、AKT1、PTEN 等靶標(biāo)蛋白，影響PI3K/Akt、HIF-1、FoxO、p53 信號(hào)通路，從而治療卵巢早衰。滋癸益經(jīng)湯治療卵巢早衰的作用機(jī)制可能還與抗氧化應(yīng)激、原始卵泡激活、細(xì)胞增殖和凋亡等途徑相關(guān)，需進(jìn)一步通過(guò)實(shí)驗(yàn)驗(yàn)證。