非生物儲存因素互作對儲藏土耳其帶殼榛子呼吸、干物質損失和黃曲霉毒素B1污染的影響

Kalliopi Mylona, Angel Medina, Naresh Magan?

（英國克蘭菲爾德大學，環(huán)境和農(nóng)業(yè)食品領域學院，應用真菌學團隊，英國 克蘭菲爾德，MK43 0AL）

榛子（Corylus avelannaL.）是一種受歡迎的樹生堅果，主要種植在土耳其和南歐。土耳其是最大的榛子生產(chǎn)國，約占世界產(chǎn)量的 75%[1]。榛子是重要的營養(yǎng)來源，尤其是脂質，包括單不飽和脂肪酸、生育酚和植物酚以及酚類化合物，所有這些成分都有益于健康[2-3]。

收獲的帶殼榛子具有良好的屏障，可以防止真菌污染和潛在的真菌毒素污染，尤其是黃曲霉毒素（AFs）。然而，榛子的干燥緩慢，尤其是自然曬干可能需要數(shù)周時間，為真菌定殖和AFs污染提供有利條件。若遇較差的儲存條件會加劇AFs的污染[1]。因此，包括歐盟在內的許多國家對此類堅果的最大黃曲霉毒素 B1（AFB1，1a類致癌物）和總 AFs有嚴格的法定限制，AFB1和總 AFs分別為 5 和 10 μg/kg[4]。

榛子與其他可食用種實一樣，具有生命，并在安全儲存和水分條件下（水分活度，aw；<0.70 aw= 7.5%～8% 水分含量（m.c.））通常進行非常低水平的呼吸。在這些條件下，雖然真菌污染物存在，但它們無法引發(fā)腐敗或毒素污染[5-6]。然而，榛子采收時非常潮濕>25% m.c.，在干燥過程中m.c. 減少到安全水平。但是，緩慢或低效的干燥和隨后的儲存可能污染上真菌，特別是黃曲霉類群（例如，黃曲霉）能在堅果上定殖，導致AFs，尤其是AFB1的污染增加。這些物種喜干（嗜旱）并且由于它們能夠產(chǎn)生相關的水解酶，能在中等濕度條件下迅速定殖富含脂質的底物[7]。這就會導致干物質損失（dry matter losses，DML）、異味和營養(yǎng)質量惡化[8]。

呼吸作用已被有效地用于測量儲存商品的代謝活動，尤其是谷物[9-14]。呼吸作用是碳水化合物的有氧氧化，由以下方程表示[15]：

這包括商品（谷物、堅果）和伴隨微生物的呼吸作用。多年來，人們一直關注微生物和商品呼吸對總呼吸的相關貢獻。Seitz等[16-17]報道，在儲存過程中，真菌對 DML的貢獻增加的速度取決于主要的 m.c.、溫度、籽粒損壞程度和污染商品的葉際表面真菌群落。

最近的研究表明，在一系列商品（谷物、花生）儲存期間CO2產(chǎn)生量的變化，可以有效地用作 DML的指標，這可能與潛在的真菌毒素污染有關[11-12,18-20]。這些研究利用碳水化合物/脂質的氧化會產(chǎn)生 CO2，在溫度×aw相互作用條件下的有氧呼吸速率來計算質量損失及 DML比例。使用氣相色譜法測定的呼吸率（R）及其相關的DML可建立“儲存風險指數(shù)”，以預測儲存的谷物和堅果中的整體質量變化和真菌毒素污染情況[8,21]。

已發(fā)現(xiàn)0.04%～2%之間的DML能影響種實質量和與歐盟法定最大限值相關的真菌毒素污染風險[11-14,17-20]。最近對儲存在不同m.c.s和溫度下的帶殼花生進行的研究量化了呼吸率和 DMLs，并將其與 AFB1污染相關聯(lián)[20]。這被用來評估不同儲存條件的相對風險，這些條件會影響超過歐盟法定限制的 AFB1污染水平。盡管榛子是一種重要的食用商品，被廣泛用于烘焙食品、巧克力零食和冰淇淋的各種加工食品鏈，但目前還沒有對榛子進行類似的研究。

本研究的目的是（a）量化呼吸速率，（b）干物質損失，（c）AFB1污染包括自然污染的榛子以及儲存之前附加接種黃曲霉毒素的榛子，并首次建立了DMLs與AFB1污染之間的關系。

1 材料與方法

1.1 儀器與設備

露點/水活度計AQUALAB 4TE系列：美國華盛頓，Decagon Instruments；伽馬輻照：12 kGy，英國斯溫登 Syngergy Health；40 mL 透明玻璃揮發(fā)性有機物分析（VOA）小瓶：Supelco 23188；免疫親和柱：奧地利圖倫，Romer。

1.2 榛子和水分吸附曲線

生榛子：土耳其馬爾馬拉研究中心TUBITAK MAM。將已知體積的無菌水（0～2 mL）加入到40 mL玻璃通用瓶中的5 g自然污染帶殼榛子樣品中。將其密封、劇烈搖晃并在4 ℃下儲存過夜以平衡水分。然后在室溫（T）下平衡樣品，使用露點/水活度計 AQUALAB 4TE系列測量每個子樣品的aw值。通過添加水量（mL）與測量的aw值作圖確定水吸附曲線。曲線用于確定每組實驗達到目標 aw水平所需的確切水量。之后，通過在105 ℃的烘箱中干燥16 h來測定樣品的m.c。

對于黃曲霉接種實驗，成批榛子（500 g× 4）最初經(jīng)過伽馬輻照以殺死所有微生物，并儲存在4 ℃的密封袋中直至使用。在此輻射劑量下，堅果保留了萌發(fā)能力，但沒有真菌污染[21]。還為輻照過的生榛子制作了水分吸附曲線。

1.3 自然污染的帶殼榛子的儲存方式對干物質損失的影響

將自然污染的帶殼榛子樣品（160 g）置于500 mL Duran燒瓶中表面消毒。參照吸濕曲線，添加無菌水以獲得0.70（對照）、0.85、0.90和0.95（=5%、10%、12.5%和18% m.c.濕重基）的目標aw值，4 ℃下儲存 24 h。每種處理四個重復（10 g），置于40 mL透明玻璃揮發(fā)性有機物分析（VOA）小瓶中，小瓶具可密封PTFE蓋，內置硅膠隔墊，以便于稍后從頂空氣體采樣。將相同aw水平的榛子樣品與 2 × 500 mL 甘油/水溶液的燒杯一起放在12-L聚丙烯環(huán)境室中培育，保持與每個aw處理值相對應的大氣目標平衡相對濕度（ERH）。榛子樣品培育 5 d。

本研究中使用的儲存處理溫度范圍為 15～30 ℃，aw范圍為 0.70～0.95。每 24 h 測量一次二氧化碳（CO2）產(chǎn)量。采樣方法涉及使用氣相色譜測量頂部空間中積累的 CO2，如 Mylona &Magan（2011）所述[11]。CO2百分比濃度用于計算（a）以mg CO2（kg/h）為單位的呼吸（R）速率，（b）儲存 5 d后 CO2的總累積量和（c）總DML[11]。

1.4 測量接種黃曲霉榛子儲存期間的呼吸活動、干物質損失和黃曲霉毒素B1污染

從榛子中分離出已知產(chǎn)黃曲霉毒素的黃曲霉菌株1217，由土耳其TUBITAK MAM友情提供。該菌株在MEA培養(yǎng)基25 ℃培養(yǎng)5～7 d。黃曲霉孢子懸浮液用作儲存實驗的接種物。用無菌環(huán)接種，將分生孢子置于 10 mL含有 0.01% Tween 80的無菌水中。劇烈搖動獲得孢子懸浮液。通過使用血細胞計數(shù)器用無菌水稀釋調節(jié)濃度至 5×107個孢子/mL。

參照水吸附曲線，用無菌水將消毒過罐中的榛子（每批100 g）調節(jié)至0.85、0.90和0.95 aw（=10%、12.5%和18% m.c.）。實際添加的水量略少以便添加接種體。在 4 ℃平衡過夜，處理組25 ℃平衡。然后將 0.2 mL等分的黃曲霉接種體加入榛子處理樣品中，并充分混合。將每個aw處理的四個重復放置在40 mL玻璃瓶中，并再次放入之前所述的環(huán)境室中培育。每個aw水平的處理和重復分別在15、20、25和30 ℃下培育。

每24 h，將用于不同處理和重復的玻璃瓶用含有硅膠隔膜（Supelco 23188）的PTFE蓋密封1 h，然后用頂空注射器采集氣體樣品。氣樣注入GC進行 CO2定量。取樣后，取下蓋子，樣品返回到每溫度和aw水平各自的環(huán)境室。每天重復該程序。

1.5 干物質損失計算

使用前面詳述的碳水化合物/脂質的有氧氧化方程。通過消耗的氧氣與產(chǎn)生的二氧化碳的比率計算呼吸商，來確定干物質損失（DML）。依方程式，每公斤谷物中 14.7 g CO2相當于 1%的DML。計算了自然污染的榛子和附加接種黃曲霉孢子的榛子的不同儲存處理的DML。

通過整合呼吸率與時間數(shù)據(jù)，確定DML百分比（%）與時間曲線關系。儲存周期時間分24 h，每個周期的CO2量通過呼吸率計算。每個周期的CO2總量為儲存期間產(chǎn)生的 CO2總量，用于計算DML。

1.6 黃曲霉毒素B1定量

在每個實驗結束時，榛子處理組/重復組在60 ℃下干燥48 h，研磨并在4 ℃下儲存，等待進一步分析。將5 g子樣品與10 mL 70%乙醇混合，置于振蕩器上1 h。使用含有10 mL去離子水的注射器過濾，并將總共 5 mL的濾液加到免疫親和柱上，濾液以3 mL /min的流速通過柱子。用20 mL去離子水以5 mL/min的流速洗滌柱子，空氣通過注射器至少3次。結合到柱子上的黃曲霉毒素用1 mL甲醇以0.5 mL/min的流速洗脫。將黃曲霉毒素收集到Eppendorf小瓶（2.5 mL）中并轉移到琥珀色玻璃液相小瓶中。

HPLC分析∶流動相由水∶甲醇∶乙腈（6∶3∶2）組成；每升加入 350 mL 4 M 硝酸和 0.120 g溴化鉀。流速為1 mL/min，柱溫為22 ℃。一式三份進樣 100 mL的樣品。熒光檢測激發(fā)波長為360 nm，發(fā)射波長為 430 nm。使用 PTFE 管（30 cm）用電化學產(chǎn)生的溴進行柱后衍生，以增強黃曲霉毒素的熒光強度。為此，在色譜柱和熒光檢測器之間放置了一個提供100 mA電流的電化學池。

1.7 統(tǒng)計分析

所有實驗三個生物學重復，進行兩次實驗。使用Microsoft Office Excel 2007和軟件包STATISTICA 9分析數(shù)據(jù)。平均值的標準誤差已在所有試驗中計算，并在圖中用豎線表示或包含在三維圖例中。

DML和毒素分析數(shù)據(jù)的統(tǒng)計分析：Shapiro-Wilk，W正態(tài)性檢驗用于評估總DML和毒素數(shù)據(jù)的正態(tài)性，而數(shù)據(jù)內方差的同質性通過Levene檢驗評估。對非正態(tài)分布的數(shù)據(jù)進行對數(shù)變換，以穩(wěn)定方差由Shapiro-Wilk W檢驗重新評估的及其正態(tài)性。通過單因素和雙因素方差分析（ANOVA）分析正態(tài)分布的數(shù)據(jù)，以確定各因素（aw和溫度）及其相互作用（aw×T）對變量影響的顯著性。通過Kruskal-Wallis秩和檢驗等級分析對數(shù)轉換仍非正態(tài)分布的數(shù)據(jù)。

DML和毒素產(chǎn)生數(shù)據(jù)之間的相關性：制作了DML數(shù)據(jù)與黃曲霉毒素 B1的散點圖。Spearman秩和檢驗用于確定每種情況下兩個變量之間相關性的顯著性。

2 結果與分析

2.1 自然污染的榛子

表1顯示了一系列水分活度（aw）條件對經(jīng)25和30 ℃下培養(yǎng) 120 h后的自然污染榛子平均呼吸率和總 DML的影響。研究表明，在這兩個溫度下，呼吸速率和 DML都隨著可用水的增加而增加。值得注意的是，在相對安全的儲存條件（0.70 aw）下，即使在兩個溫度下與非常低的相關 DML培育 120 h后，呼吸也很少發(fā)生。在0.85 aw，呼吸速率和 DML都開始增加，并在兩溫度下最濕的0.95 aw處理中觀察到最高值。值得注意的是，在最大可用水處理中，溫度增加到30 ℃時，呼吸速率是25 ℃時的兩倍多。

表1 在(a) 25和(b) 30 ℃培養(yǎng)120 h后，水分活度和儲存溫度對自然污染榛子的累積呼吸速率和平均總干物質損失（DML ± SE）的影響Table 1 Effect of water activity and temperature of storage on accumulated respiration rates and mean total dry matter losses(DML ±SE) of naturally contaminated hazelnuts after 120 h incubation at (a) 25 and (b) 30 ℃.(a)

2.2 接種黃曲霉的榛子

在不同水分活度×溫度條件下儲存對呼吸、干物質損失和黃曲霉毒素 B1污染的影響。圖1顯示了25 ℃下 aw對接種了黃曲霉的儲存榛子的平均呼吸率的短時影響。在0.95 aw時黃曲霉定殖最為迅速。在15～30 ℃下的數(shù)據(jù)用于計算接種了額外黃曲霉的榛子的DMLs。圖2顯示了在aw×溫度的相互作用條件下，黃曲霉定殖對儲存榛子DMLs的影響。無論儲存溫度如何，15～20 ℃時的呼吸率都非常低。僅在25和30 ℃以及≥0.90 aw時才有顯著的DMLs。

圖1 接種黃曲霉在25 ℃和三種不同水分活度下儲存的榛子呼吸時間變化（SEmax = 80.41）Fig.1 Temporal changes in respiration of stored hazelnuts inoculated with A. flavus and stored at 25 ℃ and three different water activities (SEmax = 80.41)

圖2 與儲存溫度×水分活度相關的接種黃曲霉的儲存榛子的干物質損失（SEmax = 0.9）Fig.2 Dry matter losses of stored hazelnuts inoculated with A. flavus in relation to storage temperature ×water activity (SEmax = 0.9)

圖3顯示了在15～30 ℃下不同aw水平的接種黃曲霉對榛子 AFB1污染水平的影響。圖中清楚地表明，在 20～30 ℃ 0.90 aw下產(chǎn)生了大量的AFB1，在 0.85 aw時毒素污染顯著減少。在15～20 ℃時，在 0.80 和 0.85 aw下沒有 AFB1產(chǎn)生。在產(chǎn)生 AFB1的地方，其含量均高于歐盟立法限制 5 μg/kg。

圖3 儲存溫度和水分活度對接種黃曲霉榛子10天后污染的影響Fig.3 Effect of storage temperature and water activity on contamination of hazelnuts inoculated with A. flavus after 10 days

圖4采用了依據(jù) DMLs和 AFB1污染的榛子處理方面的所有數(shù)據(jù)，并檢驗了這些數(shù)據(jù)與歐盟立法限制標準的相關性，表明 AFB1和 DMLs之間存在顯著的正相關。紅色虛線表示置信限。在大約 0.8%～1.0% DML時，存在超過歐盟法定限制的重大風險，即堅果中AFB1的最大污染。

圖4 黃曲霉毒素B1和干物質損失（%）之間的相關性Fig.4 Correlation between aflatoxin B1 and Dry Matter Losses (%)

3 討論與結論

這項研究表明，在不同溫度和可用水條件下儲存的自然污染的土耳其帶殼榛子顯著影響了相對呼吸速率和產(chǎn)生的CO2總量。CO2產(chǎn)生水平（約775 和 2 600 mg CO2/kg/h）在 25 和 30 ℃的 0.95 aw（=18% m.c.）情況下明顯更高。此前，Garcia-Cela等[20]的研究表明，帶殼花生的最佳呼吸活動發(fā)生在 30～35 ℃時，30 ℃的總累積 CO2水平約為2 080 mg CO2/kg/h，這些堅果的脂質和堅果的呼吸作用都很高，相關的自然菌群可能會影響整體呼吸活動。在其他谷物商品中，也發(fā)現(xiàn)水稻、糙米和玉米的總呼吸活性在≥0.95 aW時最佳，尤其是在30～35 ℃接種黃曲霉時表現(xiàn)明顯[14,19]

總累積CO2用于量化不同儲存條件下的相對DMLs。在 0.95 aw時大約 10%發(fā)生在 25～30 ℃。Garcia-Cela等[20]的研究發(fā)現(xiàn)，在 30～35 ℃和0.95 aw時，殼花生中的 DMLs約為 14%～15%。在玉米上的研究表明，在這些條件下，DML發(fā)生高達17%。相比之下，水稻和糙米接種黃曲霉時，DMLs分別為3.5%和20%[19]。未加工的水稻可受到外部保護層的保護，與加工過的糙米相比，減少了真菌的潛在侵入。

在本研究中，在0.95 aw和20～30 ℃下，附加接種黃曲霉能導致最大的呼吸活性和 DMLs。這相當于在30 ℃和0.95 aw下質量損失約為10%。附加接種并沒有導致貯藏榛子中的 DML顯著升高。這與小麥、玉米或帶殼花生形成鮮明對比，他們在接種產(chǎn)毒真菌時DMLs要高得多[12,14]。

在 20～30 ℃中，AFB1的產(chǎn)量在 0.90 aw時明顯高于 0.85 或 0.80 aw。這表明，在<0.85 aw時，產(chǎn)生這種致癌真菌毒素的風險顯著降低，尤其是在 15～20 ℃時，更是如此。依據(jù) DMLs和 AFB1在不同 aw×溫度條件下產(chǎn)生的所有數(shù)據(jù)繪制的圖，提供了有關毒素污染超過法定限制的相對風險的有用信息。圖中清楚地表明，在 0.6%～1%DML下，榛子的污染將超過推薦的最大污染水平。這說明干物質的微小損失會導致 AFB1污染超過法定限制，從而可能導致此類批次可能被拒。

這也表明，儲存的土耳其帶殼榛子由真菌腐敗造成損失的耐受較低，尤其在無效的干燥方式更是如此。榛子富含脂質，從而吸濕性很強。因此，它們通?？梢栽诓珊髢Υ嫫陂g干燥后重新吸收環(huán)境中的水分，從而導致產(chǎn)毒素腐敗真菌的定殖。此前對谷物的研究發(fā)現(xiàn)，A型和B型單端孢霉烯、玉米赤霉烯酮（小麥）和伏馬毒素水平（玉米）引起的約1%的霉菌毒素污染就超過了歐盟立法限制[11-14,22]。對于花生等富含脂肪酸的堅果，AFB1超過法定限制的污染水平為 0.56%[20]。因此，堅果的耐受性可能比谷物低得多。如果榛子被有效干燥到安全的水分含量，它可能會更好，保護堅果肉不被真菌毒素定殖和污染。然而，需要注意的是，堅果和外殼之間的內部空間有時可以為嗜干真菌如黃曲霉的生長提供微環(huán)境，這種情況特別容易在外殼因害蟲或在收獲和干燥階段受損時發(fā)生[23]。巴西堅果中就發(fā)現(xiàn)這種情況，從而導致殼堅果中的 AFB1污染增加[24]。這些研究信息可以被有效地從風險管理的角度加以利用，為人類消費或動物飼料使用，制定出低、中和高風險的不同分類類別[13]。

備注：本文的彩色圖表可從本刊官網(wǎng)（http:// lyspkj.ijournal.cn）、中國知網(wǎng)、萬方、維普、超星等數(shù)據(jù)庫下載獲取。