全球食品和飼料鏈中生物毒素早期預警、監測和毒性評估的挑戰和解決方案

Rudolf Krska, Eskola Mari, Berthiller Franz, Nielen Michel, Oswald Isabelle,Elliott Chris, McNerney Oonagh, BotanaLuis Miguel, Malachová Alexandra

（1. 維也納自然資源與生命科學大學，生物分析與農業代謝組學研究所，農業生物技術系，奧地利 圖爾恩 3430；2. 貝爾法斯特女王大學，生物科學學院，全球食品安全研究所，英國 北愛爾蘭 貝爾法斯特 BT9 5DL；3. Medfiles 臨床實驗有限公司，芬蘭 萬塔 01640；4. 瓦赫寧根大學，有機化學實驗室，荷蘭 瓦赫寧根6708 PB；5. 圖盧茲大學，食品毒理學研究中心，法國 圖盧茲塞地斯 F-31027；6. IRIS數字工程公司，西班牙 巴塞羅那08940；7. 圣地亞哥德孔波斯特拉大學，獸醫學院藥理學系，西班牙 盧戈 27002；8. 奧地利飼料和食品質量、安全和創新能力中心，奧地利 圖爾恩 3430）

1 食品和飼料鏈中的生物毒素

食品、寵物食品和動物飼料中受到有毒的天然物質（即生物體產生的所謂生物毒素）污染是整個食品和飼料鏈（包括水產養殖業）利益相關方十分關心的問題。上述生物體包括真菌、植物和藻類，它們分別產生真菌毒素、植物毒素和藻毒素。這些有害的次級代謝物通常是由機體的防御機制產生的，以響應其生長環境的變化。生物毒素一般以復雜的混合物形式存在于各種水產和農產品中，包括人類和動物的食品。生物毒素對人類和動物健康產生危害，可誘發多種急性和慢性的不良影響，如 DNA損傷、癌癥形成以及損害中樞神經系統、腎臟、肝臟和免疫系統，影響生殖發育，甚至死亡[1]。這些毒素不僅威脅人類身體健康，而且對牲畜和寵物的健康、福利和生產力均產生不利影響。根據歐洲食品和飼料快速預警系統（RASFF）的數據，歐盟拒收進口食品的主要原因是真菌毒素污染超標[2]。目前，歐洲食品安全局（EFSA）在最近的科學意見中認為普通歐洲消費者特別是兒童每天接觸多種生物毒素可能對其健康造成影響[3-5]。

盡管投入了大量的研究資金，但對這些有毒次級代謝物的預防和控制（早期預警系統、監測和毒理學評估）仍然面臨諸多問題，農業、食品和飼料行業易受到生物毒素污染的影響。此外，氣候變化正日益影響全球生物毒素分布地圖[6-7]。環境的變化影響生物之間的相互作用，會促進某些產毒生物的生長，并改變所產毒素的類型和數量。由于氣候變化，生物毒素對農業和水產養殖以及人類和動物的影響將會增加。造成這種情況的原因之一是溫度、濕度和蟲害對作物造成損害，而這些因素都將有助于真菌傳播和真菌毒素產生。如2013年塞爾維亞的嚴重干旱導致70%的玉米受到黃曲霉毒素（AFs）污染[8]，而用這些玉米喂養奶牛導致牛奶中發現高水平污染的黃曲霉毒素M1，高達歐盟法定限量的兩倍。據報道，植物毒素和藻毒素也面臨類似的挑戰。除了全球藻毒素發生的變化外，另一個例子是最近入侵歐洲水域的河豚攜帶致命的河豚毒素 (TTX)[9]。每年約有6萬人的中毒事件與藻類產生的毒素有關，總死亡率約為1.5%[10]。鑒于藻類的擴散和在新的地理區域流行所構成新的全球健康風險，應歐盟委員會要求，EFSA就海洋生物毒素（包括目前受歐盟法律限制的種類和新興毒素）制定了一系列科學意見[11]。此外，EFSA研究表明接觸植物毒素，特別是吡咯烷生物堿（PAs）和托烷生物堿（TAs），不僅對人類健康產生影響，而且會對兒童和某些植物性食品高消費者構成健康威脅[3]。

近年來，歐洲異常天氣條件降低了糧食和飼料的質量和安全性，由于生物毒素發生率異常的高，造成了嚴重的經濟損失[12]。據歐盟估計，每年真菌毒素造成的損失在 5%～10%的水平，這相當于主要糧食作物中僅小麥的損失就高達 12～24億歐元。與此同時，2050年世界人口估計將超過90億，生物毒素的不利影響是食品安全的重要風險因素[13]。有毒有害藻華（HABs）的發生會嚴重影響海洋養殖場中貝類和魚類的生產。根據聯合國糧食及農業組織（FAO）提供的貝類水產養殖數據，2000—2009年HABs對歐洲經濟的損失達7 540萬美元，占貝類行業總價值的7%。僅就歐洲貽貝產業而言，2000—2009年期間的損失為3 200萬美元[14]。此外，越來越多的證據表明歐洲新興出現的藻毒素與氣候變化有關，主要是由于微藻隨著海水變暖向北移動[15]。在歐洲，致命的河豚毒素（TTX）已經是一個法律問題，但事實上，它與細菌和微藻類有關，這使得對它的監測特別復雜。最近有證據表明，長期低劑量攝入TTX也是危險的。類似于TTX，劇毒的孢粉毒素和奧斯丁毒素同樣值得關注，尤其是在南歐。在地中海國家，上述毒素在過去幾年中擴張速度非常驚人，現在從希臘到南葡萄牙都有它們的身影。此外，由于海水變暖導致海洋甲藻（Gambierdiscus spp.）向北移動，由海洋甲藻產生的雪卡毒素（CTX）的擴張也令人擔憂[16]。在最嚴重的時期，由于HABs造成了大量魚類死亡，養殖戶可能損失當年的全部投資。因此，在歐洲和世界各地，農業、水產養殖業和食品行業以及所有需要在可持續經濟環境中獲得營養、安全和經濟的食品的人類都受到生物毒素的各種形式的威脅。目前對多學科知識和行動的需求是前所未有的，需要制定綜合創新方法來解決食品安全和保障問題，特別是與生物毒素有關的問題。面對這些挑戰，需要進行前沿研究和對研究人員多學科培訓，以創新和綜合的方式控制和減少食品和飼料鏈中的生物毒素。

2 生物毒素預警和監測的先進技術

生物毒素的預測、早期預警和監測對于避免其對人類和動物健康威脅以及經濟損失至關重要，亟需開發用于農業和水產養殖業中一系列生物毒素的預警和監測的新技術。新型預警系統基于衛星圖像應用、現場檢測方法以及大數據處理和管理方面的尖端技術和專業知識。對于真菌毒素和植物毒素等生物毒素或生物毒素的形成方面的現場檢測和遙感，需要采取適當風險降低措施的工具。

2.1 真菌毒素

精準預測農作物中強致癌物質黃曲霉毒素B1（AFB1）等真菌毒素的發生，可為農民和整個食品供應系統提供預警，及時采取適當措施。當2012年在巴爾干地區和 2013年在法國發生的異常天氣條件導致玉米生產嚴重中斷時，需要這種預測技術指導法律規定限量的臨時提高，并提醒歐盟委員會采取減損措施以確保糧食供應[17]。AFB1在花生供應鏈中污染問題對歐洲造成了明顯的食品安全風險[18]，僅2018年RASFF就通報了400多起進口拒收的報告[19]。根據歐盟統計局的數據，中國是歐盟前三大花生供應國之一，2017年占12%的份額。因此，一種檢測和收集整個花生鏈相關數據的綜合解決方案將有助于更好地評估黃曲霉毒素發生的風險，便于在早期階段做出更好的決策。現代技術支持包括免費提供的衛星圖像、田間和天氣信息、熱圖像和高光譜圖像等多源數據用以開發大數據模型。現有的高分辨率和大量的衛星圖像[20]提供了大量的光譜指標，是預測初級生產中真菌毒素水平的良好基礎。然而，需要進一步開發基于機器學習技術的先進算法，以提取不同輸入數據和谷物或花生中的真菌毒素之間的潛在相關性。利用衛星提供的光譜波段對植物光譜響應與真菌毒素存在之間關系的研究仍然缺乏。基于衛星預測農作物中真菌毒素發生和增長的解決方案可以繪制大型農業用地的地圖并精確控制真菌毒素的污染。當識別污染區域后將針對性地應用產后技術減少真菌毒素污染風險。

為預測大型花生筒倉運輸和儲存過程中黃曲霉毒素的形成，需要進一步優化和應用創新的產后環境實時監測系統[21]，如歐盟資助項目MyToolBox[22]中開發的基于黃曲霉生長過程中二氧化碳產生的預測模型[21]。歐盟衛生總局的報告中[23]建議在花生生產、加工和出口的所有階段都要進行官方控制。然而，通常使用的基于大型設備的確證分析方法（液相色譜–串聯質譜法–HPLC-MS/MS）非常繁瑣，真菌毒素分析通常需要 3～5 d。因此，首先使用基于側流免疫層析法（LFIA）的快速半定量方法進行快速篩選，可以在5 min內得到結果[24]。快速檢測的另一種選擇是先進的檢測平臺，其中包括中紅外衰減全反射–傅里葉變換紅外光譜方法，經濟實惠的手持式近紅外便攜式儀器以及在熒光–可見光光譜范圍內操作的便攜式儀器，這些方法都可應用在花生生產鏈對黃曲霉毒素進行靈活的現場/在線檢測[25]。這種解決方案對企業內部控制非常有利，特別是在花生批次中遇到的異常黃曲霉毒素污染的時候，使操作人員能夠進行成本效益高、頻繁和快速的檢測。由于待檢測的黃曲霉毒素含量相對較低，便攜式質譜（MS）方法顯示出巨大的潛力，其可根據花生和花生產品中的黃曲霉毒素官方限量提供準確的現場檢測及合適的靈敏度選擇。這種創新的分析解決方案將提高花生供應鏈中各個階段的監測能力，從而為更快、更好的決策提供基礎。通過不同應用程序產生的數據將來可以傳輸并存儲在數字平臺上，用于自動風險評估，并向終端用戶發送風險概況信息，整個流程如圖1所示。

圖1 控制和減少花生中黃曲霉毒素污染的概念流程圖Fig.1 High level concept diagram for the control and reduction of aflatoxin contamination in peanuts across continents

2.2 藻毒素類

在最佳生長條件下，微藻可在海洋甚至淡水環境中產生HABs。而過量施肥加上強降水共同導致水體富營養化加劇[26]，使得 HABs更加頻繁的發生，所產生的高含量藻毒素會導致魚類大量死亡。當攝入這些污染的魚類后，海洋生物毒素對人類同樣具有高度急性毒性，其不良反應從口腔周圍的輕微刺痛感到死亡不等。不同的國家已經制定了海產品中藻毒素限量以及相關檢測方法標準。世界各地對麻痹性貝類毒素（通常稱為麻痹性貝類中毒（PSP））、失憶性貝類毒素（失憶性貝類中毒（ASP））、親脂性毒素、雪卡毒素（CTXs）、短裸甲藻毒素或河豚毒素（TTXs）都有法律規定[27]。歐洲立法規定了雙殼軟體動物、棘皮動物、被囊動物和海洋腹足動物中海洋毒素的限量[28]。目前，海洋生物毒素的典型分析方法是基于高效液相色譜/熒光檢測法、高效液相色譜/紫外法和高效液相色譜–質譜/質譜法。多年來，小鼠動物實驗一直是監測藻毒素的參考方法。然而，根據動物福利保護的要求，在使用動物試驗時必須考慮到所有可能的替代、改進和減少的方法。因此，正在開發小鼠生物測定法替代方法，例如生物測定法[29]。

關于導致野生和養殖魚類大量死亡的海洋生物毒素的信息非常少[30]。海洋生物毒素的研究主要受制于純物質的可獲得性差和其未知的化學結構[31]。為了防止藻類引起的魚類和貝類污染，在歐盟資助的項目ASIMUTH中開發了藻類繁殖預測模型。該項目使用歐盟哥白尼地球觀測計劃中海洋服務提供的衛星數據，這項服務提供了包括葉綠素和浮游植物的濃度等一系列海洋參數的每日信息。ASIMUTH將這些衛星數據與海基監測數據以及當前水柱和表面水流行為的區域知識相結合，不僅有助于準確預測HABs的積累，而且還有助于預測它們在未來幾天的可能動向，為養殖戶提供了一個重要的早期預警系統，使他們能夠在有毒有害藻類大量繁殖之前提前收獲[32]。

2.3 植物毒素

為了對食物鏈中真菌毒素和植物毒素更有效的控制和預警，需要在田間地頭、邊境檢查、工業和零售整個食物鏈的不同階段對其進行現場檢測。真菌毒素和植物毒素的早期檢測可使受污染的糧食合理利用，例如用于動物飼料而非用于生物燃料。由于真菌毒素和植物毒素的種類繁多，濃度相對較低，便攜式質譜（MS）可為毒素現場檢測提供通用、靈敏和適合的檢測方法。然而，無論是較重的可移動的商業質譜系統，還是輕型的便攜式質譜設備，均未在分析真菌毒素或植物毒素中研究和應用。初步研究表明，使用基于實驗室的常壓質譜方法無需色譜分離就可以檢測到相關水平的生物毒素[33-35]。在近期兩項具有未來應用潛力的便攜式質譜研究中，使用常壓質譜對于最普遍污染的脫氧雪腐鐮刀烯醇進行了優化、驗證和基準測試[36-37]。這種高度創新的分析化學解決方案將有效提高食品鏈各個階段的監測能力，從而加強食品和飼料的安全保障。

3 評估生物毒素毒性的創新方法

評估包括真菌毒素和貝類毒素在內的不同種類生物毒素毒性的創新方法急需建立，特別是當它們以混合物的形式存在時。由于缺乏關于共存的真菌毒素和貝類毒素混合物的毒性數據，EFSA無法可靠評估接觸這些生物毒素混合物的健康風險。許多領域缺乏毒性數據，特別是慢性毒性數據：如作用模式（MoA）、毒物動力學、對人類和動物的毒性不良影響，包括混合物的綜合影響，以及這些毒素混合物在器官和細胞水平上的相互作用。需要更多的研究來獲取這些數據[38]。歐盟資助的 EuroMix項目研究開發了對不同生命階段的多種來源化學品混合物的風險評估的分層策略[39]。

長期接觸低至中等劑量的鐮刀菌毒素可能對人類和動物的健康產生重大的慢性影響，導致生長發育受損或免疫功能紊亂。然而，這些相關疾病往往是亞臨床或癥狀非常不明顯的。EFSA[4-5]目前對所謂的新興鐮刀菌毒素對人類和動物的毒性知之甚少。“新興”真菌毒素一詞是指既沒有常規測定也沒有立法監管的一類新型的真菌毒素；然而，關于它們所帶來危害的證據正在迅速增加[40]。由于它們與已有限量的真菌毒素共同存在，因此了解新興真菌毒素與已有限量的真菌毒素毒性相互作用就顯得非常重要。利用腸道細胞系和外植體培養物對新興真菌毒素進行腸道屏障功能的研究，并采用毒性分析以及最先進的轉錄組學和蛋白質組學方法，將提供有關新興鐮刀菌毒素的毒性作用、作用模式和相互作用的新數據。

有幾種數學和統計模型用于確定接觸真菌毒素混合物是否會對細胞培養物產生協同、相加或拮抗效應[41]。

生物標志物可以反映細胞水平的改變和早期/低劑量相關的病理變化，將為評估毒性作用提供強有力的工具。由于這些生物標志物通常與毒素非特異性關系，因此它們具有更大的潛力來反映暴露于毒素混合物和隨著時間的推移重復暴露現象，并有助于識別混合物/共同暴露的活性物質和暴露于混合物的健康危害[42]。目前，包括真菌毒素在內的大多數生物毒素尚不存在特異性和經過驗證的生物標志物。新方法可以利用體外研究和多組學技術來揭示受調控鐮刀菌毒素影響的生物標志物。經過驗證的生物標志物還將提供關于低劑量毒素混合物的綜合毒性效應的獨特信息，使風險評估人員能夠可靠地評估接觸生物毒素混合物對人類和動物健康的慢性風險。

4 氣候變化和生物毒素

最近，FAO評估和總結了氣候變化對食品安全的影響[26]；特別是考慮了食源性病原體和寄生蟲、農藥、重金屬，以及有害藻華和真菌毒素。FAO指出“今天，我們知道氣溫升高、海洋變暖和酸化、嚴重干旱和野火、不合時宜的強降水和酸雨、冰川融化和海平面上升以及極端天氣事件加劇正在對糧食系統造成前所未有的破壞。”應對人類活動對地球氣候的影響是人類面臨的最大挑戰之一[43]。其最大的影響是氣候系統前所未有的變暖，進而引發更頻繁和更極端的天氣事件，包括熱浪和降雨分布和強度的變化。這些影響將導致農業耕種和可種植的作物范圍的調整。氣候影響以及我們如何改變農業以應對氣候變化，都將造成適應不同氣候條件的真菌病原體的污染范圍和發生率的變化。不斷變化的天氣條件是影響真菌、新陳代謝和與宿主植物相互作用的主要驅動變量。因此，目前不斷被強調的氣候多變性和不確定性調整，不僅是政策制定者需要面臨的問題，也是農民每天需要面臨的，因為氣候變化會對真菌和真菌毒素發生影響。然而，科學界沒有為這一問題挑戰做好充分準備。

由歐盟理事會發起的《農業、糧食安全和氣候變化聯合計劃倡議》（FACCE-JPI）指出“解決與氣候變化有關的食品安全問題也是糧食安全的重要組成部分。減少和控制這些風險與公共衛生和經濟均相關[44]。”在真菌毒素領域，減輕生物毒素問題的必要性變得尤為明顯。最新的研究綜述顯示，估計全球多達80%的植物源食品受到了這些有毒次級真菌代謝物污染[45]。

5 結論

為了在氣候變化的世界中更好的保護人類和動物健康，有效應對食品和飼料中生物毒素的挑戰，需要采取一系列措施來建立創新的綜合解決方案，包括提升食品和飼料中共存生物毒素的預警、監測和毒性評估能力。為實現這一目標，需要在農業、食品科學、分析化學、組學和毒理學的各個學科中，具備頂級科學水平的多學科的技能。未來需要進一步開展更前沿的研究，例如使用無人機圖像的大數據方法以及使用蛋白質組學、轉錄物組學和代謝組學工具，以控制和減少從田間到餐桌的生物毒素，并盡量減少食品和飼料損失。在歐盟–中國項目 MyToolBox[17]框架下2019年在北京舉行的專題研討會也證明，當前仍然非常需要智能和綜合的策略來解決真菌毒素問題，以實現更安全的食品和飼料產品，并盡量減少損失和出口拒收[45]。

備注：本文的彩色圖表詳見本期 PC31，也可從本刊官網（http://lyspkj.ijournal.cn）、中國知網、萬方、維普、超星等數據庫下載獲取。