尼日利亞納薩拉瓦州市售灌木芒果、腰果、秋葵、芝麻和高粱的真菌毒素污染情況研究

Isaac M Ogara, Michael Sulyok, Anthony Negedu, Kolawole I Ayeni,Zega M Zebedee, John D Mamman, Abiodun Adedokun, Janet I Ogara,Eunice A Adgidzi, Chibundu N Ezekiel,?, Rudolf Krska,

（1. 納薩拉瓦州立大學，沙布拉菲亞校區，農學院農學系PMB 335，尼日利亞 納薩拉瓦州凱菲，950101；2. 維也納自然資源與生命科學大學（BOKU），生物分析與農業代謝組學研究所，農業生物技術學院（IFA-Tulln），奧地利 圖爾恩，20. 3430；3. 原材料研究與發展委員會，尼日利亞 阿布賈邁塔馬，904101；4. 巴布科克大學 微生物系，尼日利亞 奧貢州伊利山雷莫，121103；5. 納薩拉瓦州立大學 農業學院 基礎科學系化學組PMB 335, 尼日利亞納薩拉瓦州拉菲亞，950101；6. 納薩拉瓦州立大學 農業學院 家庭科學系，沙布拉菲亞校區PMB 335，尼日利亞 納薩拉瓦州拉菲亞，950101）

聯合國糧農組織指出，全球平均膳食能量攝入量從2005年每天的2 753 kcal/cap，增加到了2016 年每天的 2 904 kcal/cap[1]，表明全球食物供應量有了顯著的增加。盡管食物供應量劇增，但撒哈拉以南非洲（SSA）仍有相當一部分人營養不良，其基本因素雖然復雜，但食物作物受到真菌毒素污染和貧困因素歸為其中[2-3]。盡管這些因素并不局限于某一特定區域，但真菌毒素威脅造成的負擔在諸如尼日利亞等的SSA國家中還是非常高的，這些地區采收前后的作物栽培和管理的措施非常不完善，并且氣候條件助長了食品受真菌毒素污染的頻率[4-11]。每天連續攝入真菌毒素，依據污染食物攝取量，會對人體產生一系列有害影響。這些影響范圍從急性（如惡心、嘔吐）到慢性（如癌癥），甚至死亡[2,12]。

在尼日利亞，灌木芒果(拉丁學名Irvingia gabonensis，在當地稱為dikanut或 ogbono)、腰果(Anacardium occidentaleL.)、秋葵(Abelmoschusesculentus(L.) Moench)、高粱(Sorghum bicolorL.)和芝麻(Sesamum indicumL.)食物等作物是大多數家庭消費的主食，可在不同的市場買到。分自芒果果實的大部分干燥種子（a drupe）和新鮮秋葵的全果（制成的一種膠囊）或者干燥碾成粉可分別做成濃稠的ogbono和okro湯[9,13-15]。高粱是一種谷物，而芝麻是一種小油籽，二者在尼日利亞的不同地區都有廣泛種植。在尼日利亞，高粱主要被加工成傳統的食物，如masa，ogi，tuwo和waina[4,16]，而芝麻通常首選作食用油，也可作為食物的香料[16-18]。高粱和芝麻也可作為傳統加工飲料（如kunu）的原料[19-20]?？狙ǔＷ鳛榧词承〕允秤谩？傊@些食物作物是尼日利亞家庭膳食中十分主要的攝入成分，尤其在納薩拉瓦州所屬的北部地區。因此，為了保障消費者的健康，有必要對食品的真菌毒理學安全性進行評估。

此前的研究報道了尼日利亞不同地區高粱和芝麻[4,16,18,21]、灌木芒果[9]和腰果[22]的真菌毒素污染情況。然而，關于納薩拉瓦州市售的這類食品真菌毒素情況的數據很少。此外，在來自納薩拉瓦州的玉米[6,23]、即食家庭食品[24]和人類尿液[25]中，測量到了很高含量的真菌毒素混合物。因此，納薩拉瓦州可能成為真菌毒素中毒的熱點地區，因此，有必要評估該州不同食物來源受真菌毒素的影響。此外，監測公共市場出售的食品和通常作為主食消費的食物作物是否受到真菌毒素污染是十分重要的，這樣有利于提供數據，進而為可行的干預措施提供信息。因此，本研究旨在闡明在納薩拉瓦州市售的灌木芒果、腰果、干秋葵、高粱和芝麻的真菌毒素污染情況。

1 材料與方法

1.1 樣品采集

從尼日利亞納薩拉瓦州的主要市場購買了107份食物作物，其中灌木芒果（n=12）、烤腰果（n=12）、干秋葵（n=12）、芝麻（n=35）和高粱（n=36）。在該州的三個農業區（南部地區（拉菲亞地區）、北部地區（阿克旺加地區）和西部地區（凱菲地區）選擇了具代表性的主要市場。在每個市場中，隨機選擇食物作物供應商；每五家供應商中選中一家。從每個隨機選擇的供應商中采集一份食物作物樣本。芝麻和高粱樣本每份重1 kg，每份依取自儲藏箱不同部分形成3～4份子樣品，而其他食物樣本重約300 g，包括4個隨機選擇的預包裝食品子樣品。采集的食品樣本在供應商商店儲存不超過14 d。所有食品樣品立即研磨成粉并儲存在-20 ℃至分析用，多種真菌毒素的分析在奧地利生物分析和農業代謝組學研究所（IFA-Tulln）進行。

1.2 樣品的多種真菌毒素分析

采用 Sulyok等[26]報道的 LC-MS/MS方法來定量分析食物樣品中包括真菌毒素在內的500多種微生物代謝物。

1.2.1 化學藥品

甲醇（色譜級）和冰醋酸（分析級）：默克公司（德國達姆施塔特）；乙腈（色譜級）：VWR公司（比利時魯汶）；醋酸銨（質譜級）：西格瑪奧德里奇公司（奧地利維也納）；真菌毒素標準品根據Abia等的研究報道[27]，真菌毒素標準品：其他研究組提供或購自商業公司；實驗用水：Elga Purelab超分析系統反滲透連續凈化制備，威立雅公司（英國巴克斯）。

1.2.2 儀器與設備

50 mL聚丙烯試管：德國紐布瑞赫特，莎斯特；GFL 3017振蕩培養箱（旋轉搖床）：德國布格韋德爾；QTrap 5500 LCMS/MS系統：美國加州福斯特，應用生物系統公司；電噴霧電離源（ESI）源、1290系列 HPLC系統：德國瓦爾特布隆，安捷倫公司；色譜柱、保護柱：美國加利福尼亞州托倫斯，飛諾美公司。

1.2.3 代謝物的提取和回收率的測定

每個樣品取5 g，置于50 mL聚丙烯試管中，用20 mL萃取劑（乙腈∶水∶醋酸=79∶20∶1，v/v/v）萃取代謝物。測定回收率時，每個樣品取0.25 g加入100 μL多標物母液，放置一夜，以建立樣品和加標物之間的平衡，隨后用1 mL（乙腈∶水∶乙酸 = 79∶20∶1，v/v/v）均一化。上述樣品用GFL 3017振蕩培養箱（旋轉搖床）振蕩提取90 min，提取液用稀釋溶劑（乙腈∶水∶醋酸=20∶79∶1，v/v/v）稀釋為 1∶1（v/v），并在LC-MS/MS儀器上樣并分析[28]。

1.2.4 LC-MS/MS 參數

微生物代謝物的 LC-MS/MS篩選測定采用QTrap 5500 LCMS/MS系統，配備電噴霧電離源（ESI）源和 1290系列 HPLC系統。色譜柱為Phenomenex Gemini C18（150 mm×4.60 mm，5 μm），保護柱為 Phenomenex C18（4 mm×3 mm，5 μm），溫度 25 ℃，色譜方法、色譜和質譜參數按照Sulyok等的報道[26]。ESI-MS/MS在多反應監測（MRM）模式下，每個樣品兩次色譜運行中對每種分析物進行兩次裂解反應掃描。各分析物的MRM 檢測窗口分別設置為正離子和負離子模式下其保留時間±20 和±26 s。

鑒定通過獲得每種分析物兩個 MRMs（串珠鐮刀菌素除外，其僅顯示一個碎片離子）進行確認。根據歐洲委員會2002/657號決議會產生的4個識別點值。此外，兩個MRM躍遷的LC保留時間和強度比分別在 0.1 min和30%內與真實標準相關值一致。

1.2.5 真菌毒素的定量

基于線性、1/x稱重校準，使用外標定量，多組分母液梯度稀釋。對回收率的濃度進行了校正。該方法的準確性通過多實驗室間比較研究得到驗證[26,30]，包括BIPEA組織的常規方案（法國熱訥維耶）。檢出限和定量限根據歐拉赫姆指南在低濃度水平上加標樣品的標準差確定。

1.3 數據分析

SPSS 17.0 Windows版本用于分析真菌毒素數據。采用簡單的描述性統計用于分析食品中真菌毒素/代謝物分布的相關數據。食物作物中的真菌毒素濃度使用方程 y=Log10（1+真菌毒素含量μg/kg）進行轉換，創建用于比較毒素水平的正態分布。所有分析的誤差水平均設置為5%。

2 結果與分析

2.1 LC-MS/MS方法的測定結果與微生物代謝物概況

表1列出了來自納薩拉瓦州食物作物的80種真菌和細菌代謝物的LC-MS/MS方法測定結果。灌木芒果、腰果、干秋葵、芝麻和高粱等的代謝物回收率范圍分別為 38.9～167、23.9～602、9.3～243、9.2～225和61.0～140。大量偏離100%回收率的情況主要歸因于基質效應，而萃取步驟的回收率被發現符合大多數分析物的性能標準(例如70%～120%)[26]。檢測限范圍為0.008～240 μg/kg?？傮w而言，在107份食品樣本中檢出的所有真菌毒素中，脫氧雪腐鐮刀菌烯醇是最常見的真菌毒素（發生率：65%；范圍：8.7～256 μg/kg；平均值：63.6 μg/kg），而伏馬毒素的污染水平最高（發生率：22%；范圍：3.7～2 938 μg/kg；平均值：477 μg/kg（圖1）。

表1 尼日利亞納薩拉瓦州市售的常見食物作物中代謝物的方法測定結果Table 1 Method performance characteristics for metabolites in commonly consumed food crops marketed in Nasarawa state, Nigeria

續表1

圖1 尼日利亞納薩拉瓦州銷售的107份常見食物作物樣本中的真菌毒素水平Fig.1 Mycotoxin levels in 107 commonly consumed food crop samples marketed in Nasarawa state, Nigeria

2.2 高粱和芝麻中的真菌毒素

高粱和芝麻中真菌毒素和其他真菌代謝產物的含量數據見表2。在高粱樣品中，共檢測到14種真菌毒素，包括黃曲霉毒素 B1（AFB1）、伏馬毒素（FB1）、脫氧雪腐鐮刀菌烯醇（DON）、赭曲霉毒素A（OTA）和玉米赤霉烯酮（ZEN）；而在芝麻樣品中，檢測到8種真菌毒素（包括DON，FB1和 ZEN），在所有芝麻樣品中，均未檢測到AFB1和OTA。我們在高粱樣品中的AFB1、OTA和ZEN研究結果與尼日利亞、埃塞俄比亞和突尼斯之前的報道一致，這些國家在高粱中也發現了類似的真菌毒素[4,32-34]。黃曲霉毒素 B1污染了19%的高粱樣品（最大：4.75 μg/kg；平均值：2.04 μg/kg）。這低于 Makun 等[4]和 lahouar等[33]來自尼日利亞和突尼斯流行率的報告水平，分別是 54%（最大值：1 164 μg/kg；平均值：199.5 μg/kg）和59.4%（最大值：31.7 μg/kg）。造成這差異的顯著原因，可能與高粱樣品的質量和數量有關。Makun等[4]分析了 168份明顯發霉的高粱，這可能導致了具有更高的流行率；而 Lahouar等[33]則分析了另外的高粱樣本（n=64）。然而，我們的結果卻高于Chala等報告的埃塞俄比亞的70份的高粱結果，其結果為12.9% (最大值：62.5 g/kg；平均值：29.5 g/kg)。我們在芝麻樣品中未檢測到AFB1的結果與尼日利亞之前的報告一致，在高原地區的 17種芝麻中均未發現黃曲霉毒素[18]。然而，卻與伊朗和埃及已報道的形成了對比，伊朗和埃及報告芝麻樣品中 AFB1含量分別為 18.1%（平均值：1.62 μg/kg）并且60%以上的芝麻樣含該毒素（平均值：66.74 μg/kg）[35-36]。

表2 尼日利亞納薩拉瓦州市售的芝麻和高粱中真菌毒素和其他微生物代謝產物的檢測Table 2 Occurrence of mycotoxins and other microbial metabolites in sesame and sorghum marketed in Nasarawa state, Nigeria

高粱和芝麻中檢出了伏馬毒素，包括伏馬毒素 B1、B2、B3和B4。伏馬毒素B1污染了較多的高粱樣品（發病率：47%；最大值：2 105 μg/kg；平均值：461 μg/kg）、較少的芝麻樣品（發病率：9%；最大：15.4 μg/kg；平均值：12.5 μg/kg）。本研究高粱樣品中檢測到的伏馬毒素含量（FB1、FB2和FB3之和）的最大值和平均值分別高達2 862 μg/kg和730 μg/kg。這些值高于之前在埃塞俄比亞高粱中報告的伏馬毒素含量（FB1、FB2和FB3之和）（最大值：40.99 μg/kg；平均值：22.22 μg/kg），也高于尼日利亞的四個農業生態區（最大值：179 μg/kg；平均值：150 μg/kg）[32,37]，但低于尼日利亞尼日爾州四個小氣候區20份高粱樣品中的含量（最大值：8 400 μg/kg；平均值：6 198 μg/kg）[34]。然而，本研究的芝麻中 FB1+FB2的含量水平（最大值：21.7 μg/kg；平均值：18.8 μg/kg）與先前在阿布賈（尼日利亞北部）24份芝麻樣本中報告的水平相似（最大值：37.9 μg/kg；平均值：25.9 μg/kg）[38]。脫氧雪腐鐮刀菌烯醇是芝麻中最常見的真菌毒素（發生率：100%；最大：256 μg/kg；平均值：114 μg/kg），也是高粱中最常見的真菌毒素（發病率：97%；最大：19.5 μg/kg；平均值：13.4 μg/kg）。我們在芝麻中的脫氧雪腐鐮刀菌烯醇含量高于Fapohunda等[38]報告的脫氧雪腐鐮刀菌烯醇數據（發病率：58%；最大：171 μg/kg；平均值：78.3 μg/kg）。本研究高粱樣品有 16%污染了赭曲霉毒素A（最大：42.9 μg/kg；平均含量為16.5 μg/kg）。這污染率低于Makun 等[21]及 Onyedum等[34]分別報道的 94%（最大值：29.5 μg/kg；平均值：8.28 μg/kg）和 75%（最大值：5.60 μg/kg；平均值：2.44 μg/kg）。相反的還有我們的芝麻樣品，沒有一個被赭曲霉毒素A污染的，這與Makun等[21]的觀察結果形成了鮮明的對比，他們報告的尼日爾州（尼日利亞北部）19份芝麻 100%被赭曲霉毒素A污染。約29%的芝麻和8%的高粱樣品含有玉米赤霉烯酮：最高（平均）濃度分別為4.33（1.82）μg/kg 和 10.6（8.25）μg/kg。然而，據報道，來自尼日利亞和埃塞俄比亞的芝麻和高粱中的 ZEN污染率分別為 100%（最大值：1.25 μg/kg；平均值：0.806 μg/kg）和 32.9%（最大值：374 μg/kg；平均值：43.8 μg/kg）[32,39]。我們的這些結果與以往文獻報道的有關這兩種農作物的結果之間的差異可能歸因于多種因素，包括各研究分析的樣本量不同、在進行各項分析時分析儀器性能的差異、不同地理環境的影響、農業（采收前后）規范措施，以及污染食物作物的真菌多樣性。在高粱和芝麻中定量的21種其他真菌代謝產物中，大黃素（emodin）/曲酸（kojic acid）/大孢菌素（macrosporin）和色醇（tryptophol）分別在97%和100%的樣品中出現。

2.3 灌木芒果、腰果和秋葵中的真菌毒素

在灌木芒果、腰果和干秋葵中，真菌毒素和其他微生物代謝物的分布（發生率和含量）見表3。在檢測到的10種真菌毒素中，灌木芒果中檢測到6種（AFB1、AFG1、AFM1、交鏈孢酚甲醚、環丙酮酸和OTA），腰果中檢測到2種（AOH和BOU），干秋葵中檢測到7種（除AFG1、AFM1和AOH外）。灌叢芒果樣本中的AFB1（最大值：19.2 μg/kg）和AFM1（最大值：1.41 μg/kg）的含量比先前報道的拉各斯（尼日利亞南部）市場40份灌木芒果樣品中的 AFB1（713.2 μg/kg）和 AFM1（25.5 μg/kg）的最高水平分別低37倍和13倍[9]。這些差異的原因主要是采收后的儲存時間和條件。本研究中的樣品在供應商處存放時間不超過 14 d，而 Ezekiel等[9]分析的樣品存放時間為15～90 d，其報道最大污染水平發現在儲存時間越長的變色樣品中。

表3 在尼日利亞納薩拉瓦州市售的腰果、灌木芒果和干秋葵中的真菌毒素和其他微生物代謝物Table 3 Mycotoxins and other microbial metabolites in cashew nut, bush mango and dried okra marketed in Nasarawa state, Nigeria

續表3

在本研究中分析的干秋葵樣品只有 3/12（25%）受到AFB1污染，其含量達到8.27 μg/kg。此前，在尼日爾州（尼日利亞北部）的20份秋葵中未檢測到黃曲霉毒素[40]，而我們發現的黃曲霉毒素含量高于貝寧、馬里和多哥（最大：5.4 μg/kg）[41]和土耳其（最大：1.7 μg/kg）[42]市場上報道的含量。在這里，我們還報告了一份干燥秋葵樣品（3.4 μg/kg）的OTA污染情況，之前沒有黃秋葵OTA污染的報告。秋葵是一種易腐的食物作物，通常是從農場新鮮收獲來的；然而，為了延長其保質期，銷售商將秋葵果實切成小塊以曬干保質。在大多數情況下，秋葵是在裸露的土壤上干燥的，因此，秋葵暴露于土壤真菌和接觸環境中產生的霉菌孢子[13]。也許，這種粗陋的加工/販賣方式是導致分析的秋葵樣品中存在多達7種真菌毒素的原因，包括了黃曲霉毒素B1。

在所有腰果樣本中均未檢出黃曲霉毒素，這與 Lamboni等[43]和 sombie等[44]的報道一致。他們分別在貝寧和塞拉利昂的84和50份腰果中未發現黃曲霉毒素。然而，我們的發現與 Milhome等[45]和Adetunji等[22]的報道相反，他們記錄了來自巴西和尼日利亞的腰果中黃曲霉毒素分別高達31.5 μg/kg 和 6.8 ng/g。鑒于多年來報告的腰果真菌代謝物在類型和模式上存在差異，為了更好地了解污染情況，需要對不同處理條件和來自不同大陸的食品原料在實驗室間進行綜合研究。在灌木芒果、腰果和秋葵干樣品中還檢測到了其他51種真菌代謝物，且含量不同。此外，有三種細菌的代謝物被檢測量化，包括在食物作物中唯一檢測到的氯霉素。

2.4 食品中檢測到的真菌毒素對公眾健康的影響

在對公眾健康影響的食品真菌毒素中，AFB1是最強的真菌毒素，被歸類為I類人類致癌物[46]。它的攝入與肝癌和免疫抑制有關[2,47]。所有受污染的秋葵、兩份灌木芒果和一份高粱樣品中的黃曲霉毒素濃度都超過尼日利亞食品中黃曲霉毒素總量4 μg/kg的允許限值。盡管本研究調查的樣本量相對較少，但由于每日進食會導致長期攝入黃曲霉毒素，因此任何食物含有黃曲霉毒素都會對公眾健康構成潛在風險。此外，樣品中 AFB1與其他可能致癌和具腎毒性真菌毒素（如 FB1和OTA）以及其他新出現的真菌毒素（如BEU）同時出現，值得引起關注，因為該地區廣泛食用這些食物作物[2,46,48]。在至少19%的高粱樣品中（盡管 FB1濃度較低），AFB1與 FB1共存；而在灌木芒果和干秋葵樣品中，AFB1與 OTA共存的比例分別超過 17%和 8%。這兩種真菌毒素已被報道可相互作用，加劇了對人類特別是兒童健康的不良影響[49]；然而，現研究報告的濃度的作用尚不清楚。近來從體外聯合毒理學研究中獲得的知識表明，幾種真菌毒素組合具有潛在的添加和/或協同效應[50-51]，因此可能需要進一步研究探討報告的各種毒素的作用效應。

3 討論與結論

本研究表明，在尼日利亞納薩拉瓦州當地市場上出售的主要食物作物灌木芒果、腰果、干秋葵、芝麻和高粱很容易受到真菌毒素污染。由于高粱含有14種真菌毒素，因此是最容易受影響的糧食作物。此外，本研究發現了之前未報道的干秋葵中有赭曲霉毒素A，且與黃曲霉毒素B1存在共存情況。本文提供的數據為可行的干預措施提出提供了相關參考，例如：1）在家庭層面上在高架平臺上烘干這些食品，以防止接觸裸露的土壤；2）秋葵和灌木芒果曬干后粉碎，適當包裝在氣密塑料容器或玻璃紙袋中，并在低溫（<10 ℃）下儲存，以防止真菌毒素的產生。此外，政府應通過相關機構在社區一級提供機械干燥機，以便于干燥各種農產品，從而最大限度地減少真菌生長。