液相色譜質譜聯用測定多種獸藥殘留方法中標準品穩定性的挑戰

Lidija Kenjeric, Michael Sulyok, Alexandra Malachova, David Steiner,Rudolf Krska,?, Brian Quinn, Brett Greer, Christopher T.Elliott

（1. 奧地利飼料和食品質量、安全和創新能力中心，奧地利 圖爾恩 3430；2. 奧利地維也納自然資源與生命科學大學，生物分析與農業代謝組學研究所，農業生物技術系，奧地利 圖爾恩 3430；3. 英國貝爾法斯特女王大學，生物科學學院，全球食品安全研究所，英國 北愛爾蘭 貝爾法斯特 BT9 5DL；4. 奧地利Romer實驗室診斷有限公司，分析服務部，科技園5，奧地利 圖爾恩 3430）

不同類型獸藥的極性、溶解性和穩定性方面差別極大，在多種獸藥殘留同時檢測方法開發時應特別關注[1]。大多數獸藥標準品是固體形式，需準確稱重和溶解。對于溶解而言，實驗時必須確保所使用的溶劑能夠溶解標準品并不會使標準品發生降解。因此，SANTE指南[2]和歐盟委員會決議 2002/657/EC 文件[3]均指出標準品的穩定性是方法驗證的先決條件之一。當開發溶解在不同溶劑中的不同亞類的獸殘同時分析方法時，需尋找一種簡便的標液配制操作方法。目前解決方案為將溶解在同一溶劑中的所有化合物分成一組配制成中間混合液[4-5]，然后將這些不同中間混合液配制成最終的混合儲備液，并通過逐級稀釋獲得外標標準曲線溶液。因此需要確定中間混合液和最終的混合儲備液的長期穩定性以及標準曲線溶液的短期穩定性。然而目前只有Desmarchelier等報道了大量獸藥標準品的穩定性[6]。本文考察了150種以上不同類別的獸藥標準品的穩定性，超過120種獸藥標準品在混合儲備液中的穩定性為一周，在中間混合液的穩定性為12周。這些穩定性結果有望為液相色譜串聯質譜（LC-MS/MS）多獸藥殘留分析方法中標準品的正確管理和使用提供重要參考。

1 材料與方法

1.1 試驗材料

HPLC級乙腈和甲醇以及MS級冰醋酸（p.a.）、乙酸銨：Sigma-Aldrich（奧地利，維也納）；獸藥殘留標準品：Sigma-Aldrich（奧地利，維也納）、Dr. Ehrenstorfer（德國，奧格斯堡）、歐盟標物研制實驗室（德國，柏林）或不同研究團隊贈送。本研究所檢測的獸藥標準品（>CL）根據其化學性質分為18類，具體如下：

（1）驅蟲劑：芬苯達唑、芬苯達唑砜、三苯達唑砜、三氯苯達唑亞砜、三苯達唑、阿苯達唑、阿苯達唑、阿苯達唑-2-氨基砜、亞苯砜、阿苯達唑、氯苯達唑、羥氯唑唑、氯苯達唑、奧昔苯達唑、左苯咪唑、氟苯達唑、甲苯達唑胺、莫蘭特、硝基硝酸吡蘭替唑、噻苯達唑

（2）抗原蟲類：羅硝唑、雙甲硝唑、奧硝唑、卡硝唑、異丙唑

（3）大環內酯類：多粘菌素、異粘菌素、莫粘菌素

（4）磺胺類藥物：磺胺吡啶、磺胺乙氧嘧啶、氨砜、磺胺乙酰胺、磺胺胍、磺胺嘧啶、磺胺噻唑、磺胺吡啶、磺胺嘧啶、磺胺惡唑、磺胺米特、磺胺甲嗪、磺胺甲唑、磺胺甲惡唑、磺胺洛嗪、磺胺苯唑、酞基磺胺噻唑、甲氧芐氨嘧啶（抗葉酸抗菌劑-與磺胺類協同作用）、磺胺氯噠嗪、磺胺二甲氧嘧啶、磺胺二甲嘧啶、磺胺多辛、磺胺甲氧噠嗪、磺胺間甲氧嘧啶

（5）氨基糖苷類藥物：鏈霉素、阿帕霉素、二汗鏈霉素、卡那霉素、新霉素B、紫蘇霉素

（6）大環內酯類：螺旋霉素、油甘霉素、交沙霉素、林可霉素、克林霉素、紅霉素 A、羅紅霉素、替米可霉素、泰樂菌素

（7）四環素：脫環素、甲環素、甲環素、二諾環素、氯四環素、氧四環素、強力環素

（8）喹諾酮類藥物：馬博沙星、諾氟沙星、氧氟沙星、環丙沙星、達氟沙星、恩諾沙星、奧比沙星、雙氟沙星、萘啶酸、氟甲喹、惡喹酸、全氟沙星、氟羅沙星、洛美沙星、沙氟沙星、哌啶酸、西諾沙星

（9）硝基咪唑類：甲硝唑

（10）側耳菌素：粘菌素

（11）截短側耳素：沃尼秒林、泰妙菌素

（12）β-內酰胺類：阿莫西林、氨芐西林、雙氯西林、苯唑西林、他唑巴坦、哌拉西林、替卡西林、舒巴坦、克拉維酸

（13）青霉素：青霉素G、青霉素V、鄰氯青霉素、阿斯泊西林（aspoxicilin）不確定沒查到

（14）頭孢菌素類：頭孢氨芐、頭孢噻肟、頭孢曲松、頭孢呋辛、地氟頭孢噻呋、頭孢匹林、頭孢氯銨、頭孢唑林、頭孢哌酮、頭孢噻呋、頭孢曲利、頭孢喹諾、頭孢氨芐

（15）球菌類：克拉珠利、地克珠利、尼卡巴星、氯吡氯吡醇、氟富甲酮、乙氧巴坦、羅本尼丁、德奎寧、莫能菌素、沙林霉素、拉沙洛啶、馬杜拉明、奈奎寧、氨丙利銨、二硝基哌利特

（16）抗生素類：甲砜霉素、氟芬尼考、氯霉素

（17）非甾體抗炎藥：酮洛芬、萘普生、美洛昔康、氟尼辛、卡洛芬、雙氯芬酸、布洛芬、甲芬氨酸、托芬氨酸、非羅昔布、塞來昔布

（18）糖皮質類固醇：地塞米松、氟沙松、甲基搶的松龍、倍他米松、潑尼松龍、曲安奈德。

1.2 儀器與設備

安捷倫 1290 超高效液相：Agilent Technologies，沃爾德布朗，德國；配有TurboV電噴霧電離（ESI）源的 Q Trap 5500 MS/MS：Sciex，福斯特市，加州，美國；C18保護柱：Phenomenex，托倫斯，加州，美國；超純水系統制備：ELGA Lab Water，塞勒，德國。

1.3 標準儲備液的配制

參考Desmarchelier等論文，根據分析物在特定溶劑中的溶解性制備標準儲備液[6]。固體標準品稱量（最小稱量量為 1 mg），選擇合適的溶劑定容，配制成目標濃度為1 000 μg/mL的單標標準儲備液，將單標標準儲備液超聲直到固體完全溶解。由于化合物的溶解性不同，最終使用了六種不同的溶劑：水、甲醇、甲醇+水（1∶1）、甲醇+二甲亞砜（DMSO）（1∶1）、水+乙腈（1∶1）、含1 mM氫氧化鈉的甲醇。最終，除用水配制的中間混合液存于15 mL falcon離心管中外，其余5種中間混合液配制于10 mL容量瓶，濃度為10 μg/mL。將相同溶劑的單標儲備液混合并用對應的溶劑定容，配制成混合標準品中間混合液。所有標準品溶液全部保存于-20 ℃。附件列明了174個單標儲備液和混合標準品中間儲備液的詳細信息。

1.4 標準曲線配制

使用乙腈：水（體積比為1∶1）作為溶劑1∶1、1∶3、1∶10、1∶30、1∶100 逐級稀釋配制凈溶液外標標準曲線溶液。使用 MultiQuant2.0.2軟件（Sciex，Foster City，CA，USA）采用 1/x權重對峰面積繪制標準曲線，考察凈溶液標準曲線的線性。

1.5 檢測方法

本實驗在Malachová等[7]的分析方法基礎上，通過質譜條件優化增加新化合物的 MRM 離子對。檢測儀器：安捷倫1290超高效液相串接配備TurboV 電噴霧電離（ESI）源的 Q Trap 5500 MS/MS。色譜柱：Gemini C18，（150×4.6 mm，5 μm），C18 保護柱（4×3 mm），柱溫 25 ℃。流動相：5 mM乙酸銨，甲醇∶水∶乙酸=10∶89∶1（v/v/v；洗脫液 A）和 97∶2∶1（v/v/v；洗脫液 B），超純水由實驗室超純水系統制備，流速1 mL/min。梯度洗脫程序：初始流動相100A%并保持2 min，在3分鐘內B相線性增加到50%，在9分鐘內繼續線性增加到100% B，保持4 min，然后在2.5分鐘內回到流動相初始比例。進樣量5 μL，ESI-MS/MS是在兩個單獨色譜條件下，分正負極，分段多反應監測（sMRM）模式下進行采集。ESI源參數：源溫度為550 ℃，氣簾氣為30 psi（最大壓力為99.5%氮氣 206.8 kPa）、離子源氣體 1（鞘氣）80 psi（氮氣 551.6 kPa）、離子源氣 2（干燥氣體）80 psi（氮氣 551.6 kPa）、離子噴霧電壓分別為?4 500 V和+5 500 V、碰撞氣體（氮氣）為中度。在正離子和負離子ESI模式下，目標化合物循環周期為1 000 ms，MS 暫停時間為 3 ms，檢測窗口寬度分別為 40 s（ESI+）和 52 s（ESI-）。根據 SANTE指南[2]，每個分析物選擇兩個 MRM 離子對來進行定性確證。

1.6 穩定性研究

獸藥標準品的穩定性研究采取等時測量法，即在不同的溫度下儲存不同時長的標準品，必須同時進行測量以考察獸藥標準品的穩定性[8]。等時測量法首先將所有獸藥標準品儲存在-80 ℃和-20 ℃條件下，以防止發生降解，然后根據實驗方案將獸藥標準品轉移到不同的溫度下進行不同時間段的穩定性測試。

1.6.1 短期穩定性研究

將不同種類的混合標準品中間儲備液分別取30 μL（總體積 180 μL）混合，用等體積的提取溶劑（乙腈∶水∶乙酸，79∶20∶1，v/v/v）和稀釋溶劑（乙腈∶水∶乙酸，20∶79∶1，v/v/v）混合溶劑定容至1 mL，配制成混合標準品溶液。將混合標準品溶液分別移取 50 μL于 13個進樣小瓶內，用450 μL的溶劑稀釋配制成濃度為30 ng/mL的混合標準溶液。

分別使用溶劑乙腈∶水（1∶1，v/v）、乙腈∶水∶乙酸（79∶20∶1，v/v/v），用同樣的方法配制含酸和不含酸的混合標準品溶液。短期穩定性考察以-20 ℃為參照條件、+4 ℃（冰箱）和室溫（避光或不避光）為不同溫度儲存條件，將混合標準溶液存儲1、2、4和7 d，在最后一個時間點后的第二天，將所有不同儲存條件下及參照條件（-20 ℃）下混合標準溶液取出并恢復至室溫后進行隨機序列檢測，以避免因檢測引起的任何趨勢（表1）。

表1 短期穩定性-每個條件1個混合標準品溶液（混合標準品溶液（30 ng/mL））Table 1 Short term stability–1 multi-component mix(30 ng/mL) per point

1.6.2 長期穩定性研究

長期穩定性考察的標準品為在六種不同溶劑中配制的混合標準品中間儲備液，共有17組（6個小瓶）。長期穩定性考察條件為-20 ℃、冰箱（4 ℃）和室溫（避光或者不避光保存）。對照組溫度為-80 ℃，實驗周期為 2、4、8、12周。對照組在最后一天取出，將混合標準品中間儲備液（10 μg/mL）混合并采用加酸或不加酸溶劑稀釋，使最終分析物濃度為 200 ng/mL。即從每一個條件下的六個混合標準品中分別取出 20 μL到新的進樣小瓶，然后加入 880 μL溶劑，定容至1 mL。在最后一個時間點后的第二天，將不同儲存條件下以及對照瓶（-80 ℃）的混合標準品中間儲備液取出恢復至室溫并配制成混合標準溶液進行隨機序列檢測，以避免因檢測引起的任何趨勢（表2）。

表2 長期穩定性-每個條件1個混合標準品溶液（混合標準品中間儲備液）Table 2 Long term stability–1 intermediate mixture set per point

1.7 數據分析

使用MultiQuant2.0.2軟件積分并構建標準曲線。用 Microsoft Excel 2013 軟件進行進一步的數據處理。結果顯示，通過將在測試溫度下儲存的標準品的峰面積和在對照溫度下保存的標準品的峰面積（短期為-20 ℃，長期為-80 ℃）相除得到（公式1）。

2 結果與分析

2.1 短期穩定性研究

為評估標準品在液相自動進樣器中的穩定性，我們進行了短期穩定性實驗。

結果表明+4 ℃下存儲 1～2 d是混合標準品溶液的最佳存儲條件。進一步考慮標準品溶劑發現加酸的溶劑相比于沒有加酸的溶劑對部分獸藥標準品穩定性影響較大。其中，青霉素、聚醚離子載體和喹諾酮類藥物（圖1，具體值見補充材料）明顯在沒有加酸的溶劑中更穩定。β-內酰胺在甲醇作為溶劑的混合標準品溶液中的穩定性良好，這與其他作者的報道相反[4-6]。此外，所有使用中性溶劑避光保存的混合標準品溶液即使在室溫下也能保持較好的穩定性（見補充材料），這表明當檢測較大數量樣品時，雖然需要幾天的分析時間，但中性溶劑配制的混合標準品溶液是相對穩定的。

圖1 所選分析物短期穩定性研究結果Fig.1 Results of short-term stability study for selected analytes

2.2 長期穩定性研究

長期穩定性研究證明酸性溶劑比中性溶劑更不利于青霉素、頭孢菌素、大環內酯、聚醚離子載體（圖2，具體值見補充材料）等化合物的儲存。實驗發現青霉素只能在-20 ℃中性溶劑下儲存 2周，這與 Berendsen等[9]報道的“青霉素 V在甲醇中至少有2個月的穩定性”不一致。因此，較高溫度或長時間儲存不符合青霉素的儲存標準。對于?-乳胺或頭孢菌素而言，除-20 ℃以外的任何溫度下儲存1個月都會導致幾乎完全損失（90%），這與 Okerman等[10]的研究結果一致。相比之下，大多數其他化合物在-20 ℃和+4 ℃下的穩定性良好，如磺胺類、球糖、糖皮質激素和非甾體抗炎藥（補充材料）即使在室溫下和光照下也較為穩定。以上結果表明長期儲存青霉素、頭孢菌素和?-內乳胺應在-20 ℃或-80 ℃，這與Desmarchelier等[6]推薦的儲存條件一致。

圖2 所選分析物（補充材料）的長期穩定性研究結果Fig.2 Results of long-term stability study for selected analytes (Supplementary material)

3 結論

為了保證實驗結果及科研成果的可靠性，對獸藥混合標準品中間液和最終混合標準溶液的穩定性進行了測試。結果表明，最終混合標準溶液在+4 ℃的中性溶劑儲存條件下保存一周后其穩定性良好，而且室溫下最終混合標準溶液的穩定性足夠確保完成一個完整樣品序列的采集。如果獸藥標準品的中間混合液需要儲存1個月或更長時間時，最好采用-20 ℃或更低的溫度。如果是包括青霉素類、頭孢菌素類和?-內乳胺類獸藥的混合標準品中間混合液在-20 ℃下儲存超過1個月，建議重新配制。

備注：本文的彩色圖表詳見本期PC32，也可從本刊官網（http://lyspkj.ijournal.cn）、中國知網、萬方、維普、超星等數據庫下載獲取。該論文原始數據支撐材料鏈接：https://1drv.ms/x/s!AtdxT5jN_GZ7i ymY Gy2iV0HR7Rz2