虎杖解毒顆粒(無糖型)改制前后指紋圖譜對比研究

白雨鑫，李晉齊，童榮生

0 引言

中藥指紋圖譜研究技術以復方制劑整體為研究對象，展示制劑品質的真實性、一致性和穩定性，全面評價制劑中復雜的化學成分和比例，已成為國際公認的中藥材和各制劑質量控制手段[1-2]。虎杖解毒顆粒(無糖型)是在保證原虎杖解毒顆粒處方、提取以及精制工藝不變的情況下，對成型工藝改制而得。為評價改制前后質量的變化，本研究對這兩種制劑分別建立指紋圖譜，并比較其共有峰及共有圖譜模式的差異。

1 試驗材料

1.1 藥物與試劑 虎杖解毒顆粒(無糖型)和虎杖解毒顆粒(四川省人民醫院藥學部制劑室，各10個不同批次)、大黃素(批號：110756-200110)、虎杖苷(批號：11575-200502)、射干苷(批號：111632-200501)，甲醇、乙腈為色譜純，磷酸為分析純，試驗用水為超純水。

1.2 儀器 e2695型HPLC儀(包括Waters公司2998 PDA檢測器，Empower3色譜工作站)；BP211D型電子分析天平(十萬分之一，德國Sartorius公司)；KQ-500DB型數控超聲波清洗器(昆山市超聲儀器有限公司)。

2 方法與結果

2.1 色譜條件 色譜柱：Phenomenex Gemini 110A C18(250 mm×4.6 mm，5μm)；檢測波長300 nm；柱溫30 ℃；進樣量10 μl；流動相：乙腈(A)-0.05%磷酸溶液(B)，梯度洗脫(見表1)；色譜記錄時間為120 min[3-4]。

表1 流動相梯度表

2.2 溶液制備

2.2.1 混合對照品溶液 取虎杖苷、射干苷、大黃素對照品適量，各精密稱定后置于50 ml容量瓶中，甲醇超聲溶解，放冷定容，搖勻得虎杖苷8.83 μg/ml、射干苷15.15 μg/ml、大黃素7.28 μg/ml的對照品溶液。

2.2.2 供試品溶液 取研細并過三號篩的虎杖解毒顆粒(無糖型)粉末近5 mg，精密稱定，轉移至50 ml棕色容量瓶中，加入40 ml甲醇,超聲溶解60 min，放至室溫后定容搖勻，用0.45 μm有機系微孔濾膜濾過5 ml，取續濾液，即得。同法制備虎杖解毒顆粒供試品溶液。

2.3 方法學考察

2.3.1 重復性試驗 以編號S1的同一供試品為對象，按照“2.2.2”項下方法平行制備6份供試品溶液，按“2.1”項下色譜條件進樣10 μl測定。以7號峰(虎杖苷)為參照，計算出各共有指紋峰的相對保留時間RSD范圍(0.28%～0.62%)和相對峰面積RSD范圍(0.59%～2.13%)，表明建立的方法重復性良好。

2.3.2 穩定性試驗 取制備的供試品(編號S1)溶液，按“2.1”項下色譜條件，分別于0、2、4、6、12、24 h進樣10 μl，以7號峰(虎杖苷)為參照，計算出各共有指紋峰的相對保留時間RSD范圍(0.27%～0.79%)和相對峰面積RSD范圍(0.46%～2.07%)，表明該方法制得的溶液穩定性良好。

2.3.3 精密度試驗 取制備的供試品(編號S1)溶液，按“2.1”項下色譜條件連續進樣6次，每次10 μl，分析圖譜。以7號峰(虎杖苷)為參照，計算出各共有指紋峰的相對保留時間RSD范圍(0.16%～0.57%)和相對峰面積RSD范圍(0.37%～1.83%)，表明儀器精密度良好。

2.4 指紋圖譜的建立與分析

2.4.1 指紋圖譜的重疊匹配 取10批虎杖解毒顆粒(無糖型)和虎杖解毒顆粒樣品，以“2.2.2”項下方法處理，“2.1”項下色譜條件測定。采用中藥色譜指紋圖譜相似度評價系統(2012版)導入數據，分析得到兩種制劑樣品的指紋圖譜重疊匹配圖[5]，結果見圖1、圖2。

圖1 虎杖解毒顆粒(無糖型)的指紋重疊色譜圖

圖2 虎杖解毒顆粒的指紋重疊色譜圖

2.4.2 共有峰的標定和參照峰的確認 利用多點校正進行自動匹配，中位數法生成對照圖譜，共標定了19個峰形較好、穩定出現的共有峰。其中7號峰吸收強，峰面積大且保留時間穩定，故將其作為參照峰。

2.4.3 特征成分的指認 精密吸取虎杖解毒顆粒(無糖型)、虎杖解毒顆粒和混合對照品溶液，以“2.1”項下色譜條件進樣分析，色譜圖匹配后見圖3。通過與對照品圖譜比對，指認兩種供試品溶液的特征共有峰，分別為虎杖苷、射干苷和大黃素，7號參照峰為虎杖苷。

圖3 虎杖解毒顆粒、虎杖解毒顆粒(無糖型)和混合對照品匹配色譜

2.4.4 虎杖解毒顆粒(無糖型)和虎杖解毒顆粒的共有模式比較 利用中藥色譜指紋圖譜相似度評價系統(2012版)，得到兩種供試品制劑的指紋圖譜共有模式，如圖4所示。

圖4 虎杖解毒顆粒和虎杖解毒顆粒(無糖型)共有模式注：7.虎杖苷；9.射干苷；17.大黃素

2.5 指紋圖譜的相似度分析

2.5.1 指紋圖譜中共有峰的相對保留時間和相對峰面積 以參照峰(峰7)的保留時間和色譜峰面積為1.000 0，分別計算虎杖解毒顆粒(無糖型)和虎杖解毒顆粒中共有峰(1～19號峰)的相對保留時間和相對峰面積，結果見表2～表5。

表2 虎杖解毒顆粒(無糖型)共有峰的相對峰面積

表3 虎杖解毒顆粒(無糖型)共有峰的相對保留時間

表4 虎杖解毒顆粒共有峰的相對峰面積

表5 虎杖解毒顆粒共有峰的相對保留時間

由表2～表5可知，在10個不同批次的虎杖解毒顆粒(無糖型)和虎杖解毒顆粒的指紋圖譜中，共有峰的相對保留時間RSD均小于1%，相對峰面積RSD均小于5%，表明2種制劑的工藝均穩定可行，指紋圖譜適應性良好。

2.5.2 指紋圖譜的相似度計算 將各10批供試品的色譜圖數據以AIA.格式導入中藥色譜指紋圖譜相似度評價系統(2012版)，進行相似度評價[6]。結果10批虎杖解毒顆粒(無糖型)和虎杖解毒顆粒指紋圖譜的相似度平均值分別為 0.998和0.997，RSD值分別為0.32%和0.46%，符合指紋圖譜測定要求，表明2種供試品制劑的各批次間差異較小，質量穩定性較好。

3 結果與討論

3.1 色譜條件的優化 由于復方中藥制劑成分復雜，在一個波長下難以體現所有成分的特征，本研究在供試品溶液全波長掃描基礎上，重點考察250、300、360 nm波長切換掃描，結果顯示，在300 nm條件下，檢測到的色譜峰信息更全面，基線更平穩，故作為檢測波長[7-9]。

參考相關文獻對虎杖等藥材中相關成分的色譜條件研究[10-11]，考察了不同提取溶劑(乙醇、水、甲醇)、不同柱溫(30、35、40 ℃)、不同超聲時間(30、60、90 min)、不同流動相體系(乙腈-水、乙腈-0.2%磷酸溶液、乙腈-0.05%磷酸溶液)對色譜結果的影響。結果表明，用甲醇超聲處理60 min，柱溫30 ℃，流動相乙腈-0.05%磷酸溶液，各色譜峰分離情況及峰形較好。由于供試液成分在圖譜前段重疊多、分離情況差，故對流動相前20 min降速，之后保持1 ml/min梯度洗脫。供試液中成分均在120 min前出峰，之后沒有相關色譜峰出現，故進樣時間定120 min。

3.2 虎杖解毒顆粒(無糖型)和虎杖解毒顆粒的圖譜分析和對照 虎杖解毒顆粒(無糖型)和虎杖解毒顆粒各批次的指紋圖譜相似度均大于0.98，說明創建的指紋圖譜的技術指標穩定可靠、重復性較好，能夠較好地全面反映制劑中化學成分的特征，并監控其成分及含量的變化。

對虎杖解毒顆粒(無糖型)和虎杖解毒顆粒指紋圖譜共有模式進行對照，其19個共有色譜峰的相對保留時間基本一致。結果表明，兩制劑的主要成分基本無變化，本研究為虎杖解毒顆粒(無糖型)研發的科學性、合理性提供了依據。