穿心蓮內酯脂質聚合物納米粒對膿毒血癥大鼠腎損傷的保護作用研究

李婷婷，王書夢，項 艷

0 引言

膿毒血癥是一種死亡率極高的全身性炎癥反應疾病，嚴重威脅著患者的生命健康[1]。嚴重膿毒血癥患者可出現多器官功能衰竭，而腎臟是最容易受損的臟器之一[2]。因此，緩解膿毒血癥引起的腎臟損傷具有重要的臨床意義。穿心蓮內酯(Andrographolide，AG)是從中藥穿心蓮中提取分離得到的一種二萜內酯類化合物，具有抗炎、抗病毒、抗腫瘤等藥理作用[3-5]。近年來研究顯示，AG對膿毒血癥大鼠肝損傷具有保護作用，該作用與抑制NF-κB信號通路有關[6]。但由于AG口服生物利用度較差，很難應用于臨床。

近年來，納米給藥系統在醫藥領域得到了廣泛發展，因其可提高藥物的溶解度和生物利用率，解決了許多難溶性或難吸收藥物的給藥問題。脂質聚合物納米粒(Lipid-polymer hybrid nanoparticles，LPNs)是納米給藥系統的一種，目前已應用于遞送藥物和診斷成像劑等領域[7]。為了解決AG的口服生物利用度，本研究通過納米沉淀法制備載穿心蓮內酯脂質聚合物納米粒(AG-LPNs)并對其進行表征，通過建立膿毒血癥大鼠模型，觀察AG-LPNs對膿毒血癥腎損傷的保護作用。

1 材料

1.1 動物 雄性清潔級SD大鼠60只，180～200 g，購自北京維通利華實驗動物有限公司，[SCXK(京)2016-0001]，動物飼養于清潔級動物房中，每籠3～4只，自由飲水、攝食，12 h光照/12 h黑暗，溫度20～25℃，相對濕度40%～70%。

1.2 試劑 穿心蓮內酯原料藥(分子式：C20H30O5；含量>98%)和聚乳酸-羥基乙酸共聚物購自大連美侖生物科技有限公司；穿心蓮內酯標準品購自中國藥品生物制品檢定所；大豆卵磷脂購自德國Lipoid公司；二硬脂酰基磷脂酰乙醇胺-聚乙二醇購自上海艾韋特醫藥科技有限公司；血肌酐(Scr)、血尿素氮(BUN)、中性粒細胞明膠酶相關載脂蛋白(NGAL)和腎損傷分子-1(KIM-1)檢測試劑盒購自深圳邁瑞生物公司；乙腈購自德國Merck公司；無水乙醇購自國藥集團上海化學試劑公司；RPMI裂解液，BCA蛋白定量試劑盒，TUNEL、HE染色試劑盒購自北京索萊寶公司。Bcl-2抗體、Bax抗體、Caspase-3抗體、GAPDH抗體、抗兔IgG-HRP二抗購自上海愛必信公司。

1.3 實驗儀器 SIGMA 2-16K離心機(美國Sigma公司產品)；Agilent1260高效液相色譜儀(美國Agilent公司產品)；Nano ZS 90激光粒度儀(英國Malvern公司產品)；R206型旋轉蒸發儀(上海申生科技有限公司產品)；JEM-2100場發射透射電子顯微鏡(日本電子株式會社產品)；AI600凝膠成像儀(美國GE公司產品)。

2 方法

2.1 AG-LPNs的制備 采用納米沉淀法制備AG-LPNs。將23 mg磷脂用250 μl無水乙醇溶解，分散到20 ml去離子水中，65 ℃水浴，300 r/min攪拌30 min，此為水相備用。將60 mg 聚乳酸-羥基乙酸共聚物和10 mg AG用10 ml乙腈溶解，作為有機相。將有機相與水相混合，100 r/min攪拌2 h。37 ℃旋轉蒸發，除去乙腈。將得到的溶液4 000 r/min離心10 min，除去未包載的AG沉淀，得到AG-LPNs，冷藏備用。

包封率測定：將AG-LPNs分散液中加入乙腈，超聲破乳，0.45 μm針式濾器過濾，取濾液經高效液相色譜測定AG含量。同時取AG-LPNs于超濾離心管中，3 000 r/min離心10 min，用高效液相色譜測定其AG含量。

粒徑和電位測定：采用激光粒度儀測定AG-LPNs粒徑和Zeta電位。

形態觀察：取制備的AG-LPNs，去離子水稀釋，將樣品滴加到銅網上，自然干燥，利用透射電鏡觀察納米粒的形態。

2.2 膿毒血癥模型建立和分組給藥 參考文獻[6]，采用盲腸結扎法制備膿毒血癥大鼠模型。用異氟烷將大鼠麻醉并仰臥位固定于手術臺面上，剪開腹部，暴露盲腸并結扎。假手術組進行手術，但不結扎。將模型大鼠隨機分為模型組、AG組、AG-LPNs組。同時以只進行手術，但不結扎的大鼠作為假手術組。術后12 h開始灌胃給藥。AG組和AG-LPNs組給予AG量50 mg/kg，假手術組和模型對照組給予等體積生理鹽水，每12小時給藥1次，連續給藥3 d。

2.3 血液中Scr和BUN測定 取大鼠靜脈血，室溫下靜置1 h，3 000 r/min離心10 min，取上清液，采用ELISA試劑盒進行檢測，檢測波長為450 nm，記錄吸光度值，參考說明書制作標準曲線，計算樣品Scr和BUN濃度。

2.4 尿液中NGAL和KIM-1的測定 收集大鼠尿液，尿液靜置后1 500 r/min離心5 min，取上層液進行檢測，計算NGAL和KIM-1濃度。

2.5 TUNEL染色檢測腎臟細胞凋亡情況 將腎臟組織置于10%中性福爾馬林中固定，而后修剪、脫水、透明、石蠟包埋，制作切片，加入細胞通透液處理8 min，冰浴孵育，按說明書進行TUNEL染色，滴加50 μl TUNEL染色液37 ℃濕盒內孵育1 h，PBS洗2遍，熒光顯微鏡下觀察和拍照。

2.6 HE染色檢測腎臟組織病理變化 將腎臟組織制成切片，經梯度二甲苯脫蠟，梯度酒精至水，自來水沖洗，切片分別以伊紅和蘇木素染色，自來水沖洗，酒精脫水，二甲苯透明，稍晾干后，中性樹膠封片，顯微鏡觀察并拍照。

2.7 蛋白印記實驗檢測腎臟組織Bcl-2、Bax及Caspase-3表達水平 腎臟組織經RPMI裂解液提取總蛋白，以BCA蛋白定量試劑盒對蛋白進行定量，然后制備蛋白樣品，樣品經PAGE電泳分離蛋白，后將分離的蛋白轉印至PVDF膜上，5%脫脂牛奶封閉4 h，4 ℃孵育Bcl-2(1∶1 000)、Bax(1∶2 000)及caspase-3(1∶1 000)抗體過夜。TBST洗膜后孵育抗兔IgG-HRP二抗1 h。膜經TBST洗后淋ECL發光液，置于凝膠成像儀下成像。

3 結果

3.1 AG-LPNs體外表征 如圖1所示，AG-LPNs的平均動力學直徑分別為(180±23) nm，Zeta電位為(-18±2.6) mV，其包封率和載藥量分別為86%和12%。透射電鏡下，AG-LPNs外觀呈均一的球形，可見明顯的核殼結構。

圖1 AG-LPNs體外表征圖注：A.AG-LPNs粒徑，B.AG-LPNs電位，C.透射電鏡下AG-LPNs形態

3.2 大鼠血清和尿液指標檢測 如表1所示，與假手術組相比，模型組大鼠血清Scr和BUN升高，尿液中NGAL和KIM-1升高,差異有統計學意義(P<0.01)；相較于模型組，AG組和AG-LPNs組Scr、BUN、NGAL、KIM-1均下降,差異有統計學意義(P<0.01)；與AG組相比，AG-LPNs組Scr、BUN、NGAL、KIM-1下調更為顯著,差異有統計學意義(P<0.01)。

表1 各組大鼠Scr、BUN、NGAL、KIM-1水平比較

3.3 大鼠腎臟細胞凋亡分析 如圖2所示，與假手術組相比，模型組細胞凋亡指數顯著升高(P<0.01)；與模型組相比，AG組和AG-LPNs組細胞凋亡指數明顯降低(P<0.01)，其中AG-LPNs組細胞降低更為明顯(P<0.01)。

圖2 各組大鼠腎臟組織細胞凋亡水平注：與假手術組相比，## P<0.01；與模型組相比，## P<0.01；與AG組相比，△△P<0.01

3.4 大鼠腎臟組織HE染色 如圖3所示，與假手術組相比，模型組腎臟組織可見廣泛腎小管擴張，腎小管上皮細胞空泡、變性、脫落，同時腎臟組織還可見明顯的炎性細胞浸潤和核質分離現象。AG和AG-LPNs組出現明顯改善，其中AG-LPNs組改善更為明顯。

圖3 各組大鼠腎臟組織HE染色

3.5 大鼠腎臟組織Bcl-2、Bax及Caspase-3表達水平 如圖4所示，與假手術組相比，模型組腎臟組織Bax和Cleaved Caspase-3蛋白表達顯著上調，Bcl-2蛋白表達明顯下調(P<0.01)。與模型組相比，AG和AG-LPNs組Bax和Cleaved Caspase-3蛋白表達顯著下調，Bcl-2蛋白表達明顯上調(P<0.01)。與AG組相比，AG-LPNs組Bax和Cleaved Caspase-3蛋白表達顯著下調，Bcl-2蛋白表達明顯上調(P<0.01)

圖4 各組大鼠腎臟組織Bcl-2、Bax及Caspase-3表達水平注：與假手術組相比，## P<0.01；與模型組相比，## P<0.01；與AG組相比，△△P<0.01

4 討論

近年來，納米技術在醫學中的應用取得了進步，極大地改善了小分子藥物、大分子生物藥品及診斷顯像劑等的臨床應用效果[8]。納米載體具有眾多優勢，如改善藥物的整體藥代動力學、增強藥物的溶解性和生物利用度、增強藥物的靶向性、規避固有生物學障礙、遞送不同化學性質的藥物等[9-10]。在眾多納米載體中，最突出的兩種為脂質體和聚合物納米粒[11]。脂質體具有良好的生物相容性，但其靶向分布欠佳[11-12]。而聚合物納米粒能夠有效控制藥物釋放，并在一定程度上提高藥物穩定性，但其生物相容性較差[11-12]。因此，二者的應用都受到了一定的限制。LPNs具有殼核結構，兼有脂質體和聚合物納米粒兩者的優點[13]，具有較好的發展前景。

AG作為天然化合物，在抗炎、抗病毒及抗腫瘤等方面發揮一定作用[3-5]。但AG的口服生物利用度不高，為了解決這一問題，本研究制備了AG-LPNs。結果顯示，AG-LPNs外觀呈均一的球形，可見明顯的核殼結構。檢測AG-LPNs直徑、Zeta電位、包封率和載藥量，確定其可滿足實驗要求。本研究進一步構建了膿毒血癥模型大鼠，并發現模型大鼠血清Scr和BUN、尿液中NGAL和KIM-1明顯升高。研究證實，血清Scr、BUN以及尿液NGAL、KIM-1升高與腎損傷相關[14]。組織學檢測發現，模型組腎臟組織可見廣泛腎小管擴張、腎小管上皮細胞空泡變性以及脫落，并有明顯的炎性細胞浸潤和核質分離現象。這提示本研究構建的膿毒血癥大鼠伴隨腎損傷。本研究發現，AG和AG-LPNs治療均可降低模型大鼠血清Scr和BUN，以及尿液中NGAL和KIM-1水平，且AG-LPNs效果更為顯著。組織學分析結果顯示，AG和AG-LPNs均明顯改善了膿毒血癥大鼠腎臟組織細胞的病理變化，同樣AG-LPNs效果更佳。提示以LPNs載AG可增強后者對腎損傷的保護作用。TUNEL染色觀察腎臟組織凋亡情況發現，模型大鼠腎臟組織細胞凋亡增多，而AG和AG-LPNs可降低細胞凋亡水平，并且AG-LPNs的作用更具優勢。在分子水平上，本研究發現，模型大鼠腎臟組織Bax和Cleaved Caspase-3蛋白表達上調，以及Bcl-2蛋白表達下調，而AG和AG-LPNs可抑制模型大鼠腎臟組織上述3種蛋白表達變化，并且AG-LPNs的抑制作用更強。Bax和Bcl-2分別是促凋亡和抗凋亡蛋白中的代表成員；而Caspase-3作為凋亡的執行者，其剪切體Cleaved Caspase-3增多與凋亡明顯相關[15-16]。提示AG-LPNs可調節Bax、Bcl-2及Cleaved Caspase-3蛋白表達，從而抑制膿毒血癥腎損傷大鼠腎細胞凋亡。

與傳統脂質體和聚合物納米粒相比，LPNs在藥物包封、控制藥物釋放及增強藥物攝取方面顯示出明顯優勢[16]。這些可能是本研究AG-LPNs對膿毒血癥大鼠腎損傷具有較好保護作用的原因。但AG-LPNs在體內的吸收轉運過程和作用機制仍需進一步研究。綜上所述，與AG相比，AG-LPNs對膿毒血癥大鼠腎損傷保護方面具有明顯優勢，這一優勢可能與AG-LPNs較強的抗凋亡作用有關。