一株野生血紅小菇的分離鑒定及液體培養(yǎng)基配方篩選

郭興 高智濤 范冬茹 張德巖 劉繼云 高云虹

摘要 血紅小菇（Mycena haematopus（Pers.）P.Kumm.）是珍稀藥用真菌，具有多種功能作用。液體菌種是血紅小菇產(chǎn)業(yè)邁入標(biāo)準(zhǔn)化、規(guī)模化、工廠化的必由之路，而碳源、氮源、無(wú)機(jī)鹽、維生素對(duì)血紅小菇液體培養(yǎng)擴(kuò)繁菌絲體具有重要影響。通過(guò)單因素試驗(yàn)和正交試驗(yàn)相結(jié)合，對(duì)菌絲含量進(jìn)行測(cè)定，了解菌絲生長(zhǎng)情況和各種參數(shù)之間的關(guān)系。結(jié)果顯示，血紅小菇液體最佳培養(yǎng)基配方為玉米粉40 g/L、蛋白胨4 g/L、KH2PO4 1 g/L、MgSO4 0.7 g/L、NaCl 0.2 g/L、VB1 0.001%、pH 6.5。

關(guān)鍵詞 血紅小菇;液體培養(yǎng)基;發(fā)酵

中圖分類號(hào) S646? 文獻(xiàn)標(biāo)識(shí)碼 A? 文章編號(hào) 0517-6611（2021）22-0065-05

doi：10.3969/j.issn.0517-6611.2021.22.016

開放科學(xué)（資源服務(wù)）標(biāo)識(shí)碼（OSID）：

Isolation and Identification of a Wild Mycena haematopus sanguineus and Screening of Its Liquid Medium

GUO Xing，GAO Zhi-tao，F(xiàn)AN Dong-ru et al

（Yichun Branch of Heilongjiang Academy of Forestry，? Yichun， Heilongjiang 153000）

Abstract Mycena haematopus（Pers.）P. Kumm is a rare medicinal fungus with multiple functions. Liquid strain is the only way for the industry of Pleurotus sanguineus to be standardized， large-scale and industrialized. Carbon source， nitrogen source， inorganic salt and vitamin have an important influence on the liquid culture and propagation of mycelium of Pleurotus sanguineus.The content of hyphae was determined by combining single factor test and orthogonal test to understand the growth of mycelium and the relationship between the mycelium and various parameters. The results showed that the best liquid medium formula of Pleurotus eryngii was corn flour 40 g/L， peptone 4 g/L， KH2PO4 1 g/L， MgSO4 7 g/L， NaCl 0.2 g/L， VB1 0.001%， pH 6.5.

Key words Mycena haematopus（Pers.）P. Kumm.;Liquid medium;Fermentation

血紅小菇（Mycena haematopus（Pers.）P.Kumm.），又名血柄小菇、紅葉小菇，為擔(dān)子菌亞門（Basidiomycotina）、傘菌目（Agaricales）、白蘑科（Tricholomataceae）、小菇屬（Mycena）的腐生菌[1]。初夏至秋季常簇生于腐朽程度較深的闊葉樹腐木上，分布于東北、華中等地區(qū)。菌蓋直徑2.5～5.0 cm，幼時(shí)圓錐形，逐漸變?yōu)殓娦危邨l紋;幼時(shí)暗紅色，成熟后稍淡，中部色深，邊緣色淡且常開裂呈規(guī)則的鋸齒狀;幼時(shí)有白色粉末狀細(xì)顆粒，后變光滑，傷后流出血紅色汁液。菌肉薄，白色至酒紅色。菌褶直生或近彎生，白色至灰白色，有時(shí)可見暗紅色斑點(diǎn)，較密。菌柄長(zhǎng)3～6 cm，直徑2～3 cm，圓柱形或扁，等粗，與菌蓋同色或稍淡，被白色細(xì)粉狀顆粒，空心，脆質(zhì)，基部被白色毛狀菌絲體[2]。擔(dān)孢子（7.7～11.1）×（5.8～6.9） μm，Q=1.3～1.8，Qav=1.5 橢圓形至長(zhǎng)橢圓形，無(wú)色，光滑，薄壁，內(nèi)含油滴，淀粉質(zhì)[3]。試驗(yàn)證明血紅小菇具有抗癌作用，對(duì)小白鼠肉瘤180和艾氏癌的抑制率均高達(dá)100%。為了使血紅小菇產(chǎn)業(yè)邁入標(biāo)準(zhǔn)化、規(guī)模化、工廠化，研究液體菌種生產(chǎn)勢(shì)在必行。液體菌種具有接種方便快速、發(fā)菌快、菌齡一致、制種周期短等優(yōu)點(diǎn)，可以快速提取獲得藥效成分，提高生產(chǎn)效率，因此具有廣闊的應(yīng)用前景[4-6]。鑒于此，筆者對(duì)血紅小菇進(jìn)行液體培養(yǎng)基配方的篩選，旨在為實(shí)際生產(chǎn)提供理論的指導(dǎo)。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1 供試菌株。

野生血紅小菇于2020年8月22日采自黑龍江伊春興安國(guó)家森林公園內(nèi)，編號(hào)為YCMH-1。

1.1.2 培養(yǎng)基。

斜面培養(yǎng)基：去皮馬鈴薯 200.0 g、葡萄糖 20.0 g、瓊脂 20.0 g，純水定容至 1 000 mL[7]。

液體培養(yǎng)基：葡萄糖 30 g/L、蛋白胨3 g/L、硫酸鎂0.05 g/mL、磷酸二氫鉀1 g/mL[8]。

1.1.3 試劑。

試驗(yàn)所使用的主要化學(xué)試劑均為國(guó)產(chǎn)分析純或食品級(jí)：葡萄糖、蔗糖、麥芽糖、可溶性淀粉、蛋白胨、酵母膏、尿素、硫酸銨、KH2PO4、MgSO4、CaCO3、FeSO4、ZnSO4、NaCl、HCl、NaOH、VC、VB1、VB2、VB6。玉米粉、黃豆粉經(jīng)烘干粉碎過(guò)100目。

1.1.4 儀器與設(shè)備。

主要儀器設(shè)備有超凈工作臺(tái)（東莞雅寧凈化科技有限公司）、電熱鼓風(fēng)干燥箱（廣州市旭朗機(jī)械設(shè)備有限公司）、BSD-YF3200智能精密型搖床（上海博迅醫(yī)療生物儀器股份有限公司）、YXQ-30SII高壓滅菌器（濟(jì)南杰島分析儀器有限公司）、AUW120D電子天平（日本島津）。

1.2 方法

1.2.1 菌種活化與接種。

制作試管斜面培養(yǎng)基，滅菌條件設(shè)置為121 ℃、30 min;將保藏的菌種進(jìn)行活化，無(wú)菌條件下進(jìn)行擴(kuò)繁，放入（25±1）℃的恒溫培養(yǎng)箱內(nèi)進(jìn)行培養(yǎng)[9]。

在無(wú)菌條件下，取血紅小菇菌種的10個(gè)菌塊接入到盛有150 mL液體培養(yǎng)基的250 mL三角瓶中，在搖床上以25 ℃、150 r/min的條件培養(yǎng)20 d[10]。

1.2.2 ITS序列分析。

將純化后的試管菌種送生工生物工程（上海）股份有限公司進(jìn)行ITS全序列測(cè)定。采用SK8259（真菌）試劑盒提取基因組DNA，選用真菌鑒定通用引物（ITS1：5′-TCCGTAGGTGAACCTGCGG-3′;ITS4：5′-TCCTCCGCTTATTGATATGC-3′）進(jìn)行PCR擴(kuò)增[11]。采用25 μL PCR反應(yīng)體系：Template（基因組DNA 20～50 ng/μL）0.5 μL;10×Buffer（with Mg2+）2.5 μL;dNTP（各2.5 mmol/L）1.0 μL;Taq酶0.2 μL;F（10 μmol/L）0.5 μL;R（10 μmol/L）0.5 μL;加雙蒸水至25 μL。反應(yīng)程序?yàn)?4 ℃預(yù)變性4 min，（94 ℃變性45 s，55 ℃退火45 s，72 ℃延伸1 min）30個(gè)循環(huán)，72 ℃延伸10 min，4 ℃終止反應(yīng)。將測(cè)得的ITS序列用DNAMAN進(jìn)行拼接，將ITS序列提交GenBank數(shù)據(jù)庫(kù)進(jìn)行BLAST比對(duì)[12]。

1.2.3 生物量測(cè)定方法。

菌絲體生物量的測(cè)定如下：取培養(yǎng)結(jié)束的血紅小菇液體培養(yǎng)基，將培養(yǎng)基和菌絲體一起倒入濾網(wǎng)上，并用純水反復(fù)沖洗，再將菌絲體置于培養(yǎng)皿中，放入70 ℃烘箱中至恒重后，稱重[13]。

1.2.4 液體發(fā)酵培養(yǎng)基的優(yōu)化。

進(jìn)行適宜碳源、氮源、無(wú)機(jī)鹽、維生素、pH的篩選，每試驗(yàn)重復(fù)3次。

1.2.4.1 碳源試驗(yàn)。

在配置液體培養(yǎng)基時(shí)，使用碳源分別為30 g/L的葡萄糖、蔗糖、麥芽糖、可溶性淀粉、玉米粉進(jìn)行碳源單因素試驗(yàn)。

將篩選出的最佳碳源按含10、20、30、40、50 g/L，分別配制液體培養(yǎng)基，進(jìn)一步篩選碳量試驗(yàn)。

1.2.4.2 氮源試驗(yàn)。

在配置液體培養(yǎng)基時(shí)，使用氮源分別為3 g/L的蛋白胨、酵母膏、尿素、硫酸銨、黃豆粉進(jìn)行氮源單因素試驗(yàn)。

將篩選出的最佳氮源按含1、2、3、4、5 g/L，分別配制液體培養(yǎng)基，進(jìn)一步篩選氮量試驗(yàn)。

1.2.4.3 無(wú)機(jī)鹽及不同添加量試驗(yàn)。

在配置液體培養(yǎng)基時(shí)，使KH2PO4的添加量分別為0.5、1.0、1.5、2.0、2.5 g/L。

在配置液體培養(yǎng)基時(shí)，使MgSO4的添加量分別為0.1、0.3、0.5、0.7、0.9 g/L。

另配制5組液體培養(yǎng)基，額外分別添加0.3 g/L FeSO4、CaSO4、NaCl、ZnSO 并與空白液體培養(yǎng)基進(jìn)行比較。

1.2.4.4 維生素試驗(yàn)。

在液體培養(yǎng)基中分別添加0.001% 的VC、VB1、VB2、VB6。

1.2.4.5 pH試驗(yàn)。

用HCl、NaOH將液體培養(yǎng)基的 pH 分別調(diào)為6.0、6.5、7.0、7.5、8.0。

1.2.4.6 正交優(yōu)化。

在單因素試驗(yàn)結(jié)果上，以碳源、氮源、無(wú)機(jī)鹽、維生素為影響因子，建立 L9（34）正交表（表1）。

1.2.5 數(shù)據(jù)處理及統(tǒng)計(jì)分析。

采用Excel 2010、SPSS 10.0進(jìn)行數(shù)據(jù)處理和統(tǒng)計(jì)分析。

2 結(jié)果與分析

2.1 野生血紅小菇的形態(tài)特征

所采集的YCMH-1為血紅小菇（圖1），菌蓋直徑2.8 cm，鐘形，具條紋;幼時(shí)暗紅色，成熟后稍淡，中部色深，邊緣色淡且常開裂呈規(guī)則的鋸齒狀;幼時(shí)有白色粉末狀細(xì)顆粒，后變光滑，傷后流出血紅色汁液。菌肉薄，白色至酒紅色。菌褶直生或近彎生，白色至灰白色，有時(shí)可見暗紅色斑點(diǎn)，較密。菌柄長(zhǎng)3～6 cm，直徑2～3 cm，圓柱形或扁，等粗，與菌蓋同色或稍淡，被白色細(xì)粉狀顆粒，空心，脆質(zhì)，基部被白色毛狀菌絲體。

2.2 血紅小菇的菌株鑒定及系統(tǒng)發(fā)育

菌株擴(kuò)增的ITS片段經(jīng)測(cè)序得到一個(gè)長(zhǎng)度為661 bp的序列（TGCGGAAGGAT

CATTATT-GAATACGATTGGGACTGATGCTGGCTCTTCACTG-

AGCATGTGCTCGTCTCATCTATTTATCTTCTCTTGTGCACAT-

CTTGTGGTCTTGAATTGAAACCTTTCGCATTCGTGCGGTTTG-

GGAGATTGTTAAACCTTCTCCTGCTTCATTCAAGGTCATGTT-

TTCATATACACTATAAAGTTACAGAATGTCTTTTAACGATTG-

CGCTTGTCGTAGTCATTAAACCTATACAACTTTCAGCAACG-

GATCTCTTGGCTCTCCTATCGATGAAGAACGCAGCGAAATG-

CGATAAGTAATGTGAATTGCAGAATTCAGTGAATCATCGAA-

TCTTTGAACGCACCTTGCGCCCTTTGGTATTCCGAAGGGCA-

TGCCTGTTTGAGTGTCATTAAATTATCAACCTTGCTCGCTTT-

TACTAGCTTGAGTTAGGCTTGGATGTGAGGGCTTGCTGGCT-

TCCTTCAGTGGATGGTCTGCTCCCTTTAAATACATTAGTGGG-

ATCTCTTGTGGACCGTCACTTGGTGTGATAATTATCTATGCC-

TTGAGACTTTGAAGCAAACTAATGGGAATCCGCTTATAACC-

GTCTTCGGACAATTAATGACTATTTGACCTCAAATCAGGTA-

GGACTACCCGCTGAACTTAAGCATATC），電泳見圖2。

將此結(jié)果在NCBI 上BLAST比對(duì)，結(jié)果見表2。由表2可知，最大匹配值為1 114～1 21 對(duì)比程度大;覆蓋率最高可達(dá)100%;E值為0，說(shuō)明對(duì)比完成匹配;相似性為99.39%～99.85%，表明對(duì)比結(jié)果相似性極高。綜合得出，在10個(gè)對(duì)比結(jié)果中，YCMH-1與10組血紅小菇（Mycena haematopus）相似程度較高，可以初步確定YCMH-1為血紅小菇。

2.3 碳源試驗(yàn)結(jié)果

從表3可以看出，血紅小菇菌絲體以玉米粉為碳源的吸收利用效果顯著高于其他碳源，菌絲體生物量達(dá)到6.6 g/L，與其他組存在顯著性差異。添加蔗糖的菌絲生物量次之，為4.5 g/L。因此，玉米粉為血紅小菇液體培養(yǎng)基的最佳碳源。

將篩選出的最佳碳源玉米粉按含10、20、30、40、50 g/L分別配制液體培養(yǎng)基，開展進(jìn)一步篩選碳量試驗(yàn)。從圖3可以看出，當(dāng)培養(yǎng)基中玉米粉添加量在10～40 g/L時(shí)，菌絲體生物量逐漸增加，在玉米粉添加量為40 g/L時(shí)，菌絲體生物量達(dá)到最大，為7.8 g/L。而當(dāng)玉米粉添加量繼續(xù)增加到5 g/L時(shí)，菌絲體生物量反而下降。

2.4 氮源試驗(yàn)結(jié)果

從表4可以看出，血紅小菇菌絲體以蛋白胨為氮源的吸收利用效果好于其他4種氮源，菌絲體生物量為4.1 g/L;另外血紅小菇菌絲體對(duì)酵母膏的利用效果也較好，菌絲體生物量為3.6 g/L;而對(duì)尿素和硫酸銨幾乎不能利用。因此，蛋白胨為血紅小菇液體培養(yǎng)基的最佳氮源。

將篩選出的最佳氮源蛋白胨按含1、2、3、4、5 g/L分別配制液體培養(yǎng)基，進(jìn)一步篩選氮量試驗(yàn)。從圖4可以看出，當(dāng)培養(yǎng)基中蛋白胨濃度在1～4 g/L時(shí)，菌絲體生物量逐漸增加，在蛋白胨添加量為4 g/L時(shí)，菌絲體生物量達(dá)到最大，為4.8 g/L。而當(dāng)?shù)鞍纂颂砑恿坷^續(xù)增加到5 g/L時(shí)，菌絲體生物量反而下降。

2.5 無(wú)機(jī)鹽及其添加量試驗(yàn)結(jié)果

從圖5可以看出，血紅小菇菌絲體的生物量隨KH2PO4添加量的逐漸增加出現(xiàn)先增加后降低現(xiàn)象，在KH2PO4添加量為0.5～1.0 g/L時(shí)，血紅小菇菌絲體的生物量隨KH2PO4添加量的逐漸增加而提高;在KH2PO4添加量為1.0 g/L時(shí)，菌絲體生物量最多，為4.1 g/L;而在KH2PO4添加量為1.0～2.5 g/L時(shí)，血紅小菇菌絲體的生物量隨KH2PO4添加量的逐漸增加而降低。因此，血紅小菇液體培養(yǎng)基中KH2PO4的最佳添加量為1.0 g/L。

從圖6可以看出，當(dāng)MgSO4添加量在0.1～0.3 g/L時(shí)，血紅小菇的菌絲體生物量隨KH2PO4添加量的變化不大;當(dāng)MgSO4添加量在0.3～0.7 g/L時(shí)，血紅小菇的菌絲體生物量隨KH2PO4添加量的逐漸增加而提高;當(dāng)MgSO4添加量在0.7 g/L時(shí)，血紅小菇的菌絲體生物量達(dá)到最大，為4.2 g/L;當(dāng)MgSO4添加量在0.7～0.9 g/L時(shí)，血紅小菇的菌絲體生物量隨KH2PO4添加量的逐漸增加而降低。因此，血紅小菇液體培養(yǎng)基中MgSO4的最佳添加量為0.7 g/L。

從表5可以看出，在各無(wú)機(jī)鹽濃度均為0.3 g/L時(shí)，添加了NaCl的血紅小菇菌絲體生物量為6.1 g/L，另外添加了FeSO4、CaCO3的血紅小菇菌絲體生物量分別為4.4和4.2 g/L，均高于空白對(duì)照的4.1 g/L，而添加了ZnSO4的菌絲體生物量?jī)H為0.3 g/L，對(duì)血紅小菇菌絲體的生長(zhǎng)有抑制作用。因此，血紅小菇液體培養(yǎng)基中NaCl為最佳無(wú)機(jī)鹽。

2.6 不同維生素對(duì)發(fā)酵的影響

由表6可以看出，在各維生素濃度均為0.001%時(shí)，添加VB1對(duì)血紅小菇菌絲體生長(zhǎng)具有促進(jìn)作用，效果顯著高于其他維生素，血紅小菇菌絲體生物量為5.1 g/L;其次為添加VC的血紅小菇菌絲體生物量為4.4 g/L;而添加了VB2、VB6的血紅小菇菌絲體生物量低于空白對(duì)照，表明VB2、VB6血紅小菇菌絲體生長(zhǎng)有抑制作用。因此，血紅小菇液體培養(yǎng)基中VB1為最佳維生素。

2.7 pH對(duì)發(fā)酵的影響

從圖7可以看出，血紅小菇菌絲體在pH 6.0～8.0時(shí)均可以生長(zhǎng)。pH 6.5時(shí)菌絲生長(zhǎng)速度最快，菌絲體生物量最多，為4.4 g/L，培養(yǎng)液顏色澄清、菌絲球生長(zhǎng)勢(shì)強(qiáng)、大小均勻;pH 7.0時(shí)菌絲生長(zhǎng)情況較好;當(dāng)pH在6.0～6.5時(shí)，菌絲體生物量隨著pH的升高而提高;當(dāng)pH在6.5～8.0時(shí)，菌絲體生物量隨著pH的升高而降低;在pH<6.5和pH>7.5時(shí)，菌絲體生物量均低于空白對(duì)照。因此，血紅小菇液體培養(yǎng)基的最佳pH為6.5。

2.8 優(yōu)化正交試驗(yàn)

選取碳源為玉米粉，氮源為蛋白胨，無(wú)機(jī)鹽為NaCl，維生素為VB1作為影響因子，建立L9（34）正交表，KH2PO4和MgSO4添加量分別1和0.7 g/L。

從表7可以看出，對(duì)菌絲體生物量影響最大的是碳源，其次是氮源，再次是無(wú)機(jī)鹽，最后是維生素，最佳組合是A3B3C2D 即玉米粉40 g/L、蛋白胨4 g/L、KH2PO4 1? g/L、MgSO4 0.7 g/L、NaCl 0.2 g/L、VB1 0.001%。

3 結(jié)論與討論

隨著科技的進(jìn)步，工廠化生產(chǎn)將成為食用菌產(chǎn)業(yè)發(fā)展的新方向，而體液菌種生產(chǎn)正是工廠化所必需的。

碳源和氮源是微生物生長(zhǎng)所需的最基本營(yíng)養(yǎng)因子[14]。碳源既是構(gòu)成菌體細(xì)胞的碳骨架，也可為菌體活動(dòng)提供能量來(lái)源，氮源則是菌體合成蛋白質(zhì)、核酸、維生素等必需的原料[15]。

在碳源試驗(yàn)中，血紅小菇菌絲體以玉米粉為碳源的吸收利用效果顯著高于其他碳源，玉米粉在食用菌液體發(fā)酵培養(yǎng)中的作用已被相繼報(bào)道，玉米粉為復(fù)合碳源，同時(shí)含有植物激素中的玉米素[16]、某些生長(zhǎng)因子和氮源，營(yíng)養(yǎng)豐富，能促進(jìn)菌絲體生長(zhǎng)[17]，另因玉米粉溶液的黏度比較大，增加了發(fā)酵液的黏性拉力，使得形成的菌絲球易被發(fā)酵液機(jī)械性拉開而小型化，產(chǎn)生的菌絲球數(shù)量多，而大量的生長(zhǎng)點(diǎn)更有利于菌絲體生物量的積累。在碳源濃度試驗(yàn)中，玉米粉的添加量為30 g/L效果最佳，當(dāng)繼續(xù)增加玉米粉的濃度時(shí)，血紅小菇的菌絲生物量反而降低，分析原因可能是玉米粉的黏度過(guò)大，影響了發(fā)酵液的流動(dòng)性，從而導(dǎo)致血紅小菇的菌絲體生物量減少[18]。

在氮源試驗(yàn)中，血紅小菇對(duì)有機(jī)氮和無(wú)機(jī)氮之間的利用差異很大，可能是因?yàn)橛袡C(jī)氮富含蛋白質(zhì)、脂肪酸、維生素、游離氨基酸等，且氨基酸的種類齊全。而尿素雖然屬于有機(jī)氮，但尿素僅能給生物提供氨態(tài)氮，所以效果較差。另一方面可能是由于硫酸銨會(huì)使液體培養(yǎng)基的pH發(fā)生嚴(yán)重變化，影響了菌絲生長(zhǎng)。因此，蛋白胨是血紅小菇液體培養(yǎng)基的最佳氮源。

在無(wú)機(jī)鹽試驗(yàn)中，血紅小菇液體培養(yǎng)基中KH2PO4的最佳添加量為1 g/L，MgSO4的最佳添加量為0.7 g/L，另額外添加0.3 g/L的NaCl對(duì)血紅小菇菌絲生長(zhǎng)有顯著促進(jìn)作用。在維生素試驗(yàn)中，血紅小菇液體培養(yǎng)基中添加0.001%VB 對(duì)菌絲生長(zhǎng)有顯著促進(jìn)作用。不同pH對(duì)血紅小菇菌絲的生長(zhǎng)試驗(yàn)結(jié)果表明，血紅小菇液體培養(yǎng)基的最佳pH為6.5。

通過(guò)單因素試驗(yàn)和正交試驗(yàn)相結(jié)合，對(duì)菌絲含量進(jìn)行測(cè)定，了解菌絲生長(zhǎng)情況以及和各種參數(shù)之間的關(guān)系，確定了血紅小菇液體培養(yǎng)基，意在為血紅小菇的工廠化、規(guī)模化、標(biāo)準(zhǔn)化生產(chǎn)打下基礎(chǔ)。該研究顯示，血紅小菇液體最佳培養(yǎng)基配方為：玉米粉40 g/L、蛋白胨4 g/L、KH2PO4 1 g/L、MgSO4 0.7 g/L、NaCl 0.2 g/L、VB1 0.001%。

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