鹽度脅迫對細鱗鮭幼魚呼吸代謝和抗氧化酶活性的影響

杜佳玉 吳晗閱 孟照勇 李雪東 文遜智 王茂林

摘要 挑選平均體重（4.0±1.4）g、平均體長（8.0±1.2）cm的細鱗鮭（Brachymystax lenok）幼魚，研究了不同鹽度（0、6、12、18、24、30）對細鱗鮭幼魚鰓絲和肝臟中Na+-K+-ATP、抗氧化酶（SOD、CAT）活性的影響。結果表明，不同鹽度對細鱗鮭幼魚鰓絲中Na+-K+-ATP活性及肝臟中抗氧化酶活性有顯著影響（P<0.05）。隨著鹽度的升高，細鱗鮭鰓絲和肝臟中的Na+-K+-ATP活性升高，抗氧化酶（SOD、CAT）的活性則隨著鹽度的升高而降低。雖然細鱗鮭能夠通過自身的滲透調節和抗氧化系統應對外界鹽度變化帶來的壓力，但是長期的鹽度脅迫也會給細鱗鮭幼魚機體帶來損害。研究結果為今后細鱗鮭的耐鹽度選育、養殖推廣等方面的工作提供了一定的理論依據。

關鍵詞 鹽度脅迫;細鱗鮭幼魚;Na+-K+-ATP;SOD;CAT

中圖分類號 S-917.4? 文獻標識碼 A

文章編號 0517-6611（2021）22-0114-03

doi：10.3969/j.issn.0517-6611.2021.22.027

開放科學（資源服務）標識碼（OSID）：

Effects of Salinity Stress on the Respiratory Metabolism and Antioxidant Enzyme Activities of Brachymystax lenok Juvenile

DU Jia-yu? WU Han-yue? MENG Zhao-yong 2 et al （1.Key Laboratory of Mariculture&Stock Enhancement in North Chinas Sea，Ministry of Agriculture and Rural Affairs，Dalian Ocean University，Dalian，Liaoning 116023; 2. Key Laboratory of Applied Biology and Aquaculture of Fish in Northern China，Liaoning Province，Dalian，Liaoning 116023）

Abstract Brachymystax lenok juvenile with the average body weight of （4.0±1.4） g and average body length of （8.0±1.2） cm were selected to study the effects of different salinity （0， 1 18，2 30） on the activities of Na+-K+-ATP and antioxidant enzymes （SOD，CAT） in the gill filament and liver of B.lenok juvenile.The results showed that different salinity had significant effects on the activity of Na+-K+-ATP in gill filaments and the activities of antioxidant enzymes in the liver of B.lenok juvenile（P<0.05）.With the increase of salinity，the activities of Na+-K+-ATP in gill filaments and liver increased，while the activities of SOD and CAT decreased with the increase of salinity gradient.Although B.lenok could deal with the pressure caused by the changes in external salinity through its own osmotic adjustment and antioxidant systems，long-term salinity stress could also cause the damages to the body of B.lenok juvenile.The research results provided certain theoretical basis for the future work on the selection of salinity tolerance，breeding and promotion of B.lenok.

Key words Salinity stress;B.lenok juvenile; Na+-K+-ATP;SOD;CAT

細鱗鮭隸屬于硬骨魚綱鮭形目鮭科細鱗鮭屬，一般分布于渭河上游及其支流和漢水北側支流湑水河、子午河上游的溪流中，常年水溫不宜超過20 ℃。細鱗鮭由于其肉質細嫩，脂肪含量高，具有較高的經濟價值。同時，細鱗鮭作為國家二級保護動物，在魚類學和動物地理學上也具有重要的學術研究價值 。細鱗鮭雖然屬于淡水魚類，但對鹽度具有一定的耐受性。鹽度是影響魚類生長發育和生理變化的重要因子[1-3]。鹽度脅迫會導致魚類機體的氧化酶和Na+-K+-ATP酶發生一定程度的改變。滲透調節的能力與Na+-K+-ATP酶有關，測定Na+-K+-ATP酶的活性可以了解魚類在鹽度脅迫下滲透調節的能力[4-8]。CAT和SOD等抗氧化酶具有清除機體自由基的功能，提高魚體的免疫調節能力[8-10]，因此研究鹽度脅迫對細鱗鮭幼魚酶活性的影響，有利于了解細鱗鮭在鹽度改變時作出的應對機制，提高細鱗鮭的健康養殖技術。

1 材料與方法

1.1 試驗材料 細鱗鮭幼魚由本溪恒仁漁眾不同家庭農場有限公司提供，均為人工繁育的細鱗鮭幼魚，在大連海洋大學愛尼實驗室人工循環水槽中暫養3 d，養殖水溫為（7.0±0.3）℃，pH為（7.5±0.4）。每天24 h連續充氧保持富氧的環境。

1.2 預試驗和試驗設計 將同一批次的幼魚置于鹽度為0（對照組）、6、12、18、24、30的循環水槽中，暫養24 h內觀察細鱗鮭幼魚的狀態，計算幼魚的存活率。預試驗結果表明，細鱗鮭幼魚在0～30鹽度下均能存活。

選取在暫養條件下健康狀況良好的細鱗鮭幼魚，置于試驗所需的循環水槽內。緩慢調整鹽度梯度，每天提高水體的鹽度從2至30，保持24 h富氧環境。在0、6、12、18、24、30鹽度下取樣，每個鹽度設置3個平行試驗。

1.3 樣品的制備和采集 從每個鹽度下取3尾細鱗鮭幼魚，用MS-222麻醉劑麻醉后，取其肝臟和鰓絲。每尾魚的肝臟和鰓絲分為3份，將其分別置于預冷的離心管中，做好標記后保存于超低溫冰箱中（-80 ℃）。樣品前處理：準確稱取組織重量，按照組織重量（g）：生理鹽水體積（mL）=1∶9的比例配制成10%的勻漿，2 500 r/min（CAT活性測定時轉速為10 000 r/min）離心10 min，取上清液再用生理鹽水稀釋成不同的濃度，探索最佳取樣濃度（組織的最佳取樣濃度按1%進行）。測定Na+-K+-ATP酶和抗氧化物酶所需的試劑盒為南京建成生物工程研究所提供的SOD試劑盒、ATP試劑盒、CAT試劑盒、考馬斯亮藍試劑盒，測定步驟嚴格按照說明書進行。

1.4 指標的測定

1.4.1

超氧化物歧化酶（SOD）的測定。采用羥胺法測定超氧化物歧化酶活性。當被測樣品中含SOD時，則對超氧陰離子自由基有專一性的抑制作用，使形成的亞硝酸鹽減少，550 nm下比色時測定管的吸光度值低于對照管的吸光度值，計算被測樣品的SOD活性。

1.4.2 過氧化氫酶（CAT）活性測定。過氧化氫酶在一定條件下使底物過氧化氫分解，使其在反應液中的濃度逐漸降低，在240 nm處測定過氧化氫酶的活性。

1.4.3 Na+-K+-ATP活性測定。ATP酶可分解ATP，生成ADP和無機磷，在660 nm處測定無機磷的量，從而測定ATP活性。

1.5 數據處理 采用SPSS 19.0統計軟件進行數據處理與分析，對測得的試驗數據進行單因素方差分析，差異顯著性分析采用Duncan多重比較，結果均以平均值±標準誤表示。P<0.05表示差異顯著。

2 結果與分析

2.1 不同鹽度對細鱗鮭幼魚肝臟和鰓絲中Na+-K+-ATP活性的影響

如圖1～2所示，除對照組（CK）外，隨著鹽度的增加，細鱗鮭幼魚肝臟中Na+-K+-ATP活性呈上升趨勢，對照組（鹽度為0）Na+-K+-ATP活性顯著高于鹽度為12時（P<0.05）;對照組Na+-K+-ATP活性為（6.32±0.39）U/g，是鹽度12時的1.86倍。除對照組外，隨著鹽度的增加，細鱗鮭幼魚鰓絲中Na+-K+-ATP活性呈上升趨勢，鹽度為0（CK）和30時Na+-K+-ATP活性顯著高于鹽度為6和12時（P<0.05）;鹽度30時肝臟中Na+-K+-ATP活性最高，為（2.95±0.34）U/g，是鹽度6時的2.78倍。試驗初期當鹽度發生變化時，

細鱗鮭幼魚鰓絲和肝臟中的Na+-K+-ATP活性降低，但隨著鹽度的遞增，細鱗鮭幼魚鰓絲和肝臟中的 Na+-K+-ATP活性回升，表明在鹽度梯度變化時Na+-K+-ATP酶參與細鱗鮭的滲透調節來維持機體內環境的穩定。

2.2 不同鹽度對細鱗鮭幼魚肝臟和鰓絲中CAT活性的影響 如圖3～4所示，隨著鹽度的升高，細鱗鮭幼魚鰓絲中過氧化氫的含量增加，反映出CAT酶活性呈下降趨勢。當鹽度為30時細鱗鮭幼魚鰓絲中H2O2含量最大，為（115.73±14.90）U/g，是對照組（CK）的9.59倍，是鹽度6時的2.32倍，這表明在鹽度為30時細鱗鮭幼魚鰓絲中CAT活性最低;細鱗鮭幼魚肝臟中CAT活性差異顯著（P<0.05），隨著鹽度的增加，H2O2含量增加，反映出CAT活性呈下降趨勢。對照組（鹽度0）與鹽度為6、12和18時細鱗鮭幼魚鰓絲中H2O2含量差異不顯著。鹽度為30時細鱗鮭幼苗肝臟中H2O2含量最大，為（63.28±7.27）U/g，是對照組的7.39倍，是鹽度18的8.25倍，這表明在鹽度為30時幼鱗鮭幼魚肝臟中CAT活性最低。

2.3 不同鹽度對細鱗鮭幼魚肝臟和鰓絲中SOD活性的影響 如圖5～6所示，不同鹽度下細鱗鮭幼魚鰓絲中SOD活性差異不顯著（P>0.05），不同鹽度下細鱗鮭幼魚肝臟中SOD活性差異顯著（P<0.05）。隨著鹽度的增加，細鱗鮭幼魚肝臟中SOD活性呈下降趨勢，對照組細鱗鮭幼魚肝臟中SOD活性最高，鹽度為30時細鱗鮭幼魚肝臟中SOD活性最低，對照組細鱗鮭幼魚肝臟中SOD活性是鹽度30時的1.5倍。

3 結論

該試驗結果表明，隨著鹽度的增加，細鱗鮭幼魚鰓絲和肝臟中Na+-K+-ATP活性先降低再逐漸回升，SOD和CAT的活性隨著鹽度的增加而降低。在鰓絲中，Na+-K+-ATP酶在不同鹽度梯度下差異性比超氧化物歧化酶和過氧化氫酶高。鰓是魚類調節外界生活水域與體內離子水平的重要器官，Na+、K+是鰓中最重要的調控離子，Na+-K+-ATP酶為Na+、K+離子調控提供動力。因此，當外界的鹽度梯度發生變化時，細鱗鮭幼魚鰓絲中Na+-K+-ATP活性也會發生相應的變化。細鱗鮭幼魚能夠通過自身的滲透調節、Na+-K+-ATP活性變化和抗氧化系統（主要是CAT、SOD），應對外界鹽度變化帶來的壓力，但長期的鹽度脅迫也會給細鱗鮭幼魚機體帶來損害。

4 討論

魚類在適應外界環境鹽度變化時會產生各種生理生化反應，導致體內的滲透壓和抗氧化酶活性的改變[11-12]。魚類為了維持體內滲透壓的穩定必須進行滲透壓調節，魚類滲透壓調節的能力決定了其對鹽度的耐受能力。當外界的鹽度發生改變，魚類可以通過調節Na+-K+-ATP的活性來適應外界環境的變化[13]。該試驗結果表明，隨著鹽度的逐漸增加，Na+-K+-ATP活性的改變呈現出先降低后逐漸升高，最后恢復正常的趨勢。外界鹽度升高時，魚類體內的鈉離子和氯離子需要進行跨膜運輸，Na+-K+-ATP為細胞內離子的跨膜轉運提供能量[14]。研究表明，當魚類遭受鹽度脅迫時，機體內與滲透壓相關的Na+-K+-ATP會發生顯著變化，Na+-K+-ATP在機體滲透壓的調節和離子平衡上起到關鍵作用[15]。超氧化物歧化酶（SOD）和過氧化氫酶（CAT）是評價魚類非特異性免疫的重要指標，是機體抗氧化防御系統中重要組成部分。當鹽度升高時，魚體內會產生大量的過氧化氫和超氧陰離子，這些活性氧會損傷魚類細胞，進而對魚類的生理機能造成損傷[16]。超氧化物歧化酶和過氧化氫酶可以降低這些自由基對魚類細胞的損傷[17]。孫夢蕾等[10]對紅鰭東方鲀肝臟中的SOD和CAT活性研究發現，在低鹽脅迫下SOD和CAT的表達量明顯高于對照組。該試驗結果表明，魚類在高鹽和低鹽脅迫下，其過氧化氫酶和超氧化物歧化酶的活性均會增加，因此SOD和CAT的活性可反映魚類細胞的受損程度。王曉杰等[18]對許氏平鮋的研究表明許氏平鮋血液中的過氧化氫酶、超氧化物歧化酶的活性隨鹽度的降低呈現上升的趨勢。該試驗結果表明短期的鹽度梯度變化會使細鱗鮭幼魚抗氧化酶活性增高。

鹽度作為一種生態因子，通過改變魚類的滲透壓來影響魚類的呼吸、代謝和酶的活性。目前的研究表明對魚類的滲透調節已達到分子水平。有多種基因參與到魚類的滲透調節，跨膜蛋白基因（NKA基因）參與硬骨魚類滲透調節鈉離子運輸的活躍泵，調節鈉離子和氯離子的雙向載體交換蛋白基因（NHE基因）[19]。在薩羅羅非魚和尼羅羅非魚的腸道和鰓等組織中檢測出水通道蛋白的表達。水通道蛋白基因（APQs基因）不僅對水和離子的轉運起到重要作用，而且參與甘油和尿素的轉運，對魚類的滲透壓調節具有重要意義[19]。隨著生物信息技術的發展，對魚類滲透壓調節的研究將進入數據化、信息化時代。

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