泡桐花提取物抑菌抗炎活性評價

徐立麗 李麗妍

摘要 [目的]探究泡桐花資源在飼料添加劑中的開發利用。[方法]制備蘭考泡桐花不同提取物，采用牛津杯法測定其抑菌活性，采用梯度稀釋法確定其最小抑菌濃度。利用二甲苯致小鼠耳腫脹模型和LPS誘導小鼠巨噬細胞RAW264.7炎癥模型，評價泡桐花提取物抗炎活性。[結果]泡桐花水提物對金黃色葡萄球菌、四聯球菌、大腸桿菌和沙門氏菌的抑制作用最為顯著，其醇提物對白色念珠菌具有一定的抑制作用。泡桐花水提物的抗炎作用最佳，在試驗濃度范圍內2 mg/mL泡桐花水提物對細胞內炎癥因子一氧化氮（NO）的清除能力最顯著。[結論]泡桐花水提物具有較顯著的抑菌抗炎活性，可作為理想的飼料添加劑加以開發。

關鍵詞 泡桐花提取物;抗菌;抗炎

中圖分類號 S-816.7? 文獻標識碼 A

文章編號 0517-6611（2021）22-0170-04

doi：10.3969/j.issn.0517-6611.2021.22.042

開放科學（資源服務）標識碼（OSID）：

Evaluation on the Antibacterial and Anti-inflammatory Activity of Paulownia elongate Flower Extracts

XU Li-li LI Li-yan2 （1.Anshan Health School，Anshan，Liaoning? 114000;2.Medical School，Huanghe Science and Technology University，Zhengzhou，Henan? 450063）

Abstract [Objective]To investigate the development and utilization of Paulownia elongate flower resources in feed additives.[Method]Different extracts from P.elongate S.Y.Hu flowers were prepared.The antibacterial activities of the extracts were determined by Oxford cup method，and the? minimum inhibitory concentration （MIC） of the extracts was determined by gradient dilution method.The anti-inflammatory activity of the extracts was evaluated by using xylene-induced ear swelling model and LPS induced macrophage RAW264.7 inflammatory model.[Result]The aqueous extract from P.elongate flowers had the most significant inhibitory effects on Staphylococcus aureus，Mlicrococcus tetragenus，Escherichia coli and Salmonella paratyphi，while the alcohol extract inhibited on Candida albicans.The aqueous extract from P.elongate flowers had the best anti-inflammatory effects，2 mg/mL aqueous extract from P.elongate flowers had the most significant scavenging ability on NO as intracellular inflammatory factor within the experimental concentration range.[Conclusion]The aqueous extract from P.elongate flowers had significant antibacterial and anti-inflammatory activities，so it could be used and developed as an ideal feed additive.

Key words Extract from P.elongate flowers;Anti-bacterial;Anti-inflammatory

隨著人們生活水平的逐步提高和對健康生活的不斷追求，食品安全備受關注。針對食用動物產品藥物殘留超標及耐藥性等問題的日益加劇，農業農村部2019年7月發出的第194號公告稱在我國停止生產、進口、經營和使用部分藥物飼料添加劑，并

于2020年7月1日起開始實施，這要求進一步提高動物營養與保健，調整飼料營養設計，選用新型綠色添加劑產品以替代原有抗生素，減少濫用抗生素造成的危害，維護動物源食品安全和公共衛生安全。

泡桐樹是我國資源非常豐富的速生型落葉喬木，泡桐屬共7種植物，分別為毛泡桐、蘭考泡桐、楸葉泡桐、白花泡桐、臺灣泡桐、川泡桐和南方泡桐[1]。其中，蘭考泡桐（Paulownia elongata S.Y.Hu）在我國河北、河南、山西、陜西、山東、湖北、安徽和江蘇等地均有分布。泡桐一般花期在4—5月，泡桐花在春季開花時采收，資源豐富，曬干或鮮用[2]。關于泡桐花的大量研究集中于毛泡桐，毛泡桐花中含有黃酮類、有機酸、生物堿、氨基酸、蛋白質、揮發油、多糖、酚類及靴質類成分，其中糖苷類、黃酮類物質具有抗菌、止咳、消炎、平喘等作用[3-8]，但對蘭考泡桐抗菌抗炎成分的研究報道較少[9]。為綜合開發與利用泡桐花資源，減少濫用抗生素造成的危害，筆者以蘭考泡桐花為研究對象，通過評價其抗菌、抗炎活性，分析其在動物飼料中作為添加劑應用的可能性和科學性。

1 材料與方法

1.1 試驗材料 泡桐花采自校園內，泡桐種屬經鑒定為蘭考泡桐。金黃色葡萄球菌（Staphylococcus aureus）、四聯球菌（Mlicrococcus tetragenus）、大腸桿菌（Escherichia coli）、沙門氏菌（Salmonella paratyphi）、白色念珠菌（Canidida albicans）等菌種均由黃河科技學院微生物實驗室提供。昆明系小鼠購自鄭州大學動物實驗中心。小鼠巨噬細胞RAW264.7細胞系購自武漢Procell生命科技生物公司。

1.2 試劑 阿司匹林（aspirin）、營養瓊脂、沙氏培養基均購自北京索萊寶生物科技有限公司，二甲苯購自天津科密歐化學試劑有限公司。DMEM培養基、青霉素、鏈霉素、EDTA-胰蛋白酶等均購自Gibco公司（美國）;胎牛血清購自浙江天杭生物科技股份有限公司。

1.3 儀器與設備 生物安全柜（AC2-4S1），購自新加坡ESCO科技有限公司;細胞培養箱（IN75），購自德國Memmert貿易有限公司;隔水式恒溫培養箱（GHP-9050）購自上海一恒科學儀器有限公司;空氣恒溫搖床（型號KYC-100C，上海福瑪實驗設備有限公司）;紫外可見分光光度計（722S），購自上海儀電分析儀器有限公司;多通道微孔板讀板機（Envision），購自美國PerkinElmer公司。

1.4 方法

1.4.1 泡桐花提取物的制備。

1.4.1.1 水提物的制備。取200 g泡桐花置于通風陰涼處自然干燥后，粉碎至100目待用。取上述粉末40 g，加入蒸餾水，料液比為1∶15 （m/V），常溫浸泡2 h后80 ℃下浸提1 h，過濾后留取濾液，濾渣以上述條件再浸提1次，過濾，合并濾液，減壓濃縮至浸膏后凍干備用。

1.4.1.2 丙酮提取物的制備。

取上述制備的泡桐花粉末40 g，70%丙酮以料液比1∶8 （m/V）常溫下浸提3 h，抽濾取濾液后，濾渣以上述相同條件再浸提3次，合并4次濾液，上清液于40 ℃下旋蒸濃縮至浸膏，凍干備用。

1.4.1.3 醇提取物的制備。

取上述制備的泡桐花粉末40 g，用70%乙醇室溫下浸泡泡桐花粉末2 h，料液比為1∶14 （m/V），然后70 ℃下繼續浸提1 h。抽濾分離上清液，濾渣以相同條件再浸提1 h，合并濾液后于40 ℃下減壓濃縮至浸膏，凍干備用。

1.4.2 泡桐花提取物抑菌活性的測定。供試各菌種斜面活化后，挑取少量細菌菌落接種至100 mL營養肉湯培養基中，置于恒溫振蕩培養箱中培養12 h（37 ℃，120 r/min）;真菌接種至100 mL PDA液體培養基，并置于恒溫振蕩培養箱中培養12 h （27 ℃，150 r/min），備用。

采用牛津杯法測定提取物的抑菌活性。用無菌吸管取1 mL充分混合的菌懸液于試管中，加入無菌生理鹽水，調整菌懸液OD600 nm至0. 以生理鹽水作為空白對照。每板取1 mL菌懸液充分混合于相應固體培養基平板中。

稱取適量提取物樣品，分別用水配制濃度為100 mg/mL泡桐花水提物溶液，以0.5%DMSO配制濃度100 mg/mL的泡桐花醇提物和酮提物樣品溶液。牛津杯中分別加入200 μL樣品溶液，每個濃度樣品重復3次，同時分別設置空白對照。37 ℃恒溫培養箱中培養24 h，測量抑菌圈直徑，結果取平均值。

1.4.3 泡桐花各提取物的MIC值測定。配制濃度分別為100.000、50.000、25.000、12.500、6.250、3.125 mg/mL的提取物系列溶液，其中水提物用水溶解配制，醇提物和酮提物用0.5%的DMSO溶劑配制。用相應液體培養基調整上述制備的菌懸液OD600 nm為0. 于96孔板中加入90 μL/孔的菌懸液，再分別加入配制好的各濃度提取液10 μL/孔，混合均勻后放入培養箱中振蕩培養12 h后，測定OD600 nm。每孔設3個重復，3次平行試驗。以不含藥品的營養肉湯或液體PDA為空白對照，測定最小抑菌濃度。

1.4.4 泡桐花提取物對二甲苯致小鼠耳腫脹度的影響。

取雄性昆明系小鼠30只，隨機分為空白對照組（生理鹽水組）、阿司匹林組、泡桐花水提物組、醇提物組和酮提物組，每組6只。各組小鼠連續灌胃給藥7 d，灌胃量為1 mg/g，阿司匹林組劑量為0.02 mg/g，末次給藥前禁食不禁水12 h，末次給藥30 min后，在每只小鼠耳廓兩面均勻涂抹30 μL二甲苯[10]。以左耳作為對照，1 h后脫頸處死。剪下雙側耳廓，用6 mm打孔器在同一位置沖下兩耳耳片，用電子天平稱重，以左右兩耳片重量之差表示耳部炎癥的腫脹度，并按照以下公式計算腫脹抑制率（%）：腫脹抑制率=（空白對照組平均腫脹度 - 給藥組平均腫脹度）/空白組平均腫脹度×100%。

1.4.5 泡桐花提取物對LPS誘導的小鼠巨噬細胞Raw264.7細胞系炎癥反應的影響。

1.4.5.1 泡桐花提取物細胞毒性評價。根據“1.4.4”試驗結果，選取泡桐花水提物和醇提物進行細胞水平炎癥反應試驗。CCK-8法用于評價2種提取物對小鼠巨噬細胞系RAW264.7的細胞毒性作用。細胞用含10%FBS、100 U/mL 青霉素和100 U/mL鏈霉素的DMEM培養基在37 ℃培養箱中（5%CO 空氣濕度95%）培養至細胞融合度至80%，消化鋪板于96孔板，每孔100 μL，接種密度為2×104個細胞/孔。培養過夜后，分別加入泡桐花水提物和醇提物，系列濃度為1、2、4和8 mg/mL，以不加泡桐花提取物的組作為空白對照組。培養24 h后加入10%CCK-8工作液，繼續培養1 h后，測定OD450 nm。按照以下公式計算細胞存活率（%）：細胞存活率=（OD空白對照組-OD藥物組）/OD空白對照組×100%。

1.4.5.2 泡桐花提取物對LPS誘導的RAW264.7細胞系一氧化氮（NO）產生量的影響。將細胞融合度80%的細胞板以2×105個細胞/mL的密度鋪96孔板，每孔100 μL。過夜后分為LPS組（終濃度為0.5 μg/mL）、LPS+阿司匹林組（LPS、阿司匹林終濃度為20.0 μg/mL）、LPS（終濃度為0.5 μg/mL）+泡桐花水提物組（終濃度分別為0.5、1.0、2.0 mg/mL）。不加任何藥物的細胞作為對照組。細胞培養24 h后取培養液，4 ℃ 下1 000 r/min離心10 min，取上清，用于NO含量測定。

Griess法測定NO含量（Sittisart 等[11]），以濃度3.125～100.000 μmol/L的NaNO2繪制標準曲線，計算樣品培養液中NO含量。以NO2-的質量分數為橫坐標，以吸光度為縱坐標，繪制標準曲線，標準曲線相關方程為y=0.039 4x+0.069 4（R2=0.999 1）。

2 結果與分析

2.1 蘭考泡桐花不同提取物的得率 蘭考泡桐花水提取物得率為11.20%，70%乙醇提取物得率為10.59%，70%丙酮提取物得率為8.95%。

2.2 泡桐花不同提取物抑菌試驗結果 泡桐花不同提取物的抑菌試驗結果見表1。由表1可知，蘭考泡桐花不同提取物對金黃色葡萄球菌、四聯球菌、大腸桿菌和沙門氏菌均具有一定的抑制作用，泡桐花醇提取物對真菌白色念珠菌有一定的抑制作用。提取物在相同濃度下，對革蘭氏陽性菌四聯球菌和金黃色葡萄球菌的抑制效果最佳，對革蘭氏陰性菌大腸桿菌和沙門氏菌的抑制作用次之。由此可見，泡桐花不同提取物對革蘭氏陽性菌的抑菌效果最為顯著。

2.3 MIC測定結果 泡桐花不同提取物的最小抑菌濃度結果見表2。由表2可知，泡桐花水提物對細菌的抑制作用最為顯著，其對四聯球菌、金黃色葡萄球菌、大腸桿菌和沙門氏菌的MIC值分別為6.25、6.25、25.00、25.00 mg/mL。泡桐花醇提物對真菌白色念珠菌的MIC值為50.00 mg/mL。總體而言，泡桐花不同提取物對以四聯球菌和金黃色葡萄球菌為代表的革蘭氏陽性菌的MIC值較小，即抑制效果最為顯著，對革蘭氏陰性菌的MIC值次之，對真菌的MIC值最大，即最不敏感，這種抑菌效果的差異性可能與革蘭氏陽性菌、革蘭氏陰性菌和真菌細胞結構組成不同相關。此外，水提物的抑菌效果比其醇提物和酮提物略好，可能與其水提物中的糖苷及黃酮苷類成分較多有關。

通過對以上試驗結果分析可知，蘭考泡桐花水提物的抑菌活性較為顯著，且泡桐花水提物在工藝上易于提取，泡桐花提取物可作為一種較為理想的替代抗生素類成分的植物飼料添加劑。

2.4 泡桐花提取物對二甲苯致小鼠耳腫脹度的影響 泡桐花不同提取物對小鼠耳腫脹的抑制程度見圖1。由圖1可知，20 mg/mL的泡桐花水提物、醇提物和酮提物下腫脹抑制率分別為62.31%、32.30%和31.14%，而4 mg/mL阿司匹林組腫脹抑制率為79.50%。泡桐花水提物的腫脹抑制率明顯高于其醇提物和酮提物，與空白對照組相比各試驗組均存在顯著差異（P<0.05）。

2.5 泡桐花提取物對LPS誘導的小鼠巨噬細胞Raw264.7細胞系炎癥反應的影響

2.5.1 泡桐花提取物的細胞毒性。

泡桐花提取物對巨噬細胞RAW264.7的細胞毒性結果見圖2。由圖2可知，0.5和1.0 mg/mL的泡桐提取物對細胞存活率幾乎沒有影響，2.0 mg/mL的泡桐水提物對細胞存活率也幾乎沒有影響，存活率為95.61%，而該濃度下泡桐花醇提物的細胞存活率降至91.50%。隨著泡桐花水提物和醇提物濃度的增加，細胞存活率呈現逐漸降低的趨勢，4.0 mg/mL的泡桐花水提物組細胞存活率降至80.20%，而泡桐花醇提物組細胞存活率降至75.60%。相同濃度下，泡桐花水提物對細胞毒性的影響更低。鑒于此，選取2.0 mg/mL作為泡桐花水提物的最大試驗濃度，考察其對細胞炎癥模型的抗炎作用。

2.5.2 泡桐花提取物對LPS誘導的巨噬細胞RAW264.7細胞系NO產生量的影響。一氧化氮（NO）作為細胞內的介質，在LPS刺激的炎癥部位釋放，這可能導致嚴重的炎癥和內毒素血癥[12-13]。 因此，在炎癥刺激下抑制NO的產生是減輕炎癥反應的有效策略。據報道，植物黃酮對LPS刺激的RAW264.7巨噬細胞產生NO有抑制作用[14-16]。因此，NO作為一個炎癥介質指標，被用于考察泡桐花水提物的抗炎活性。由圖3可知，0.5 μg/mL的LPS誘導巨噬細胞RAW264.7可以顯著提高其NO水平，說明炎癥模型制備成功，而泡桐花水提物處理后NO產生量顯著下降，且隨著泡桐花水提物濃度的升高，NO產生量呈劑量關系。2.0 mg/mL泡桐水提物可以降低NO產生量，接近20 μg/mL阿司匹林的作用結果。

3 討論與結論

為開發新型食用動物飼料添加劑，筆者選取資源豐富的蘭考泡桐花進行研究。結果表明，泡桐花不同提取物對細菌的抑制能力以其水提物最為顯著，且其對以四聯球菌和金黃色葡萄球菌為代表的革蘭氏陽性菌的抑制效果好于以大腸桿菌和沙門氏菌為代表的革蘭氏陰性菌。同時，泡桐花各提取物對白色念珠菌類真菌的抑菌試驗中發現泡桐花的醇提物在大劑量下可抑制白色念珠菌的生長。這些抑菌效果的不同可能與細菌和真菌細胞壁結構的不同相關，相對于泡桐花醇提物和酮提物，其水提物中含有大量的可溶性糖苷類、黃酮苷類、有機酸、生物堿類化合物，而大量研究表明糖苷類化合物具有抗菌活性[17-18]。對中草藥飼料添加劑的開發研究也發現，具有良好抑菌功效的活性物質主要有多糖、酚類和萜類等物質，通過改變細胞膜的通透性，抑制和調控細菌遺傳物質的表達而起到抑菌作用[19]。這也可以印證泡桐花水提物抑菌效果好于有機溶劑提取物的現象。

在動物模型抗炎試驗中也發現，泡桐花水提物的效果好于有機溶劑提取物，可能也與其含有較多的可溶性多糖和黃酮苷類成分有關。因此，后續細胞驗證模型僅考察泡桐花水提物的抗炎活性。NO是一種自由基氣體，巨噬細胞的防御功能即是通過NO介導的，因此NO可作為細胞因子在炎癥反應中扮演重要的角色[20]。NO在體內或水溶液中極易氧化成NO2-，因此可以利用其與Griess試劑反應生成的產物濃度與NO濃度具有線性關系，在540 nm處檢測NO的表達量，而促使NO表達量下調的藥物則意味著其具有抗炎活性。動物模型和細胞模型試驗結果均表明泡桐花水提物具有良好的抗炎活性，且2.0 mg/mL的泡桐花水提物與20 μg/mL的陽性藥物阿司匹林的抗炎活性接近，均可以顯著下調LPS誘導的NO大量表達。

此外，泡桐花水提物顯著的抑菌抗炎活性對于其在飼料添加途徑的可操作性也較為突出，即泡桐花作為添加劑的直接添加或者制備水提物的添加方式均比有機溶劑提取物的添加方式更加方便、安全且環保。這對于其作為動物飼料綠色添加劑的開發是極為有利的。該研究也將深入挖掘其抗菌抗炎的單一組分，有待進一步的機理研究。

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