氧化苦參堿對小鼠肉瘤和肝癌的體內外抗腫瘤作用

劉 寧，梁蘭蘭，李淑芳，沈祥春，2，，梁 冰，

（1．貴州醫科大學基礎醫學院藥理學教研室，貴州 貴陽 550025；2．貴州醫科大學天然藥物優效利用重點實驗室，貴州 貴陽 550025）

氧化苦參堿（oxymatrine，OMT）為喹嗪啶類生物堿，是傳統中藥苦參的主要藥效成分之一。研究發現，氧化苦參堿具有抗炎、抗病毒、抗纖維化、免疫調節等多種藥理作用，近年來其抗腫瘤活性廣受國內外學者關注。本課題組前期觀察到氧化苦參堿對環磷酰胺抗S荷瘤小鼠的增效減毒作用，發現其與環磷酰胺合用可提高抑瘤率，緩解由環磷酰胺引起的白細胞減少及肝損害。為進一步了解氧化苦參堿的抗腫瘤作用，本研究采用S和H腫瘤細胞和荷瘤小鼠進行了體內、外抗腫瘤實驗，以期為氧化苦參堿的臨床應用及抗腫瘤藥物的開發提供參考和理論依據。

1 材料與方法

1.1 主要藥品與儀器

氧化苦參堿（南京昆朗醫藥有限公司，經本室純化OMT含量HPLC≥90%）。

XP-75型倒置熒光顯微鏡（日本Olympus公司）；EXL800型酶標儀（美國BLO-TEK公司）；CO培養箱（美國Thermo Forma公司）；AB104-N型電子天平（梅特勒－托利多儀器/上海有限公司）；5810R型臺式高速冷凍離心機（德國Eppendorf公司）。

1.2 動物與瘤株

健康清潔級（SPF）昆明種小鼠220只，雌、雄各半，雌鼠體質量18～22 g，雄鼠體質量18～22 g，由貴州醫科大學實驗動物中心提供，動物合格證號SYXK（黔2012－0001）。小鼠肉瘤細胞株S和小鼠肝癌細胞株H購自重慶中藥研究所，常規傳代培養。

1.3 氧化苦參堿對肉瘤S180和肝癌H22細胞增殖的影響[4]

采用四甲基噻唑藍（methylthiazolyldiphenyltetrazolium bromide，MTT）法，取對數生長期S和H細胞懸液按1×10個/mL接種于96孔培養板，置37℃、CO體積分數為5%、飽和濕度條件下預培養24 h，S和H細胞實驗分別設立空白對照組（RPMI-1640培養基）、陰性對照組（不加藥的S和H細胞懸液）、5-氟尿嘧啶（5-FU，5×10g/L）陽性對照組及5個不同濃度（1×10、1×10、1×10、1×10、1×10g/L）的氧化苦參堿培養組，每組均設3個復孔，連續培養48 h后，每孔加入5 mg/mL MTT溶液10μL。繼續培養4 h，離心棄上清，每孔加入150μL DSMO，570 nm處檢測吸光度，按下列公式分別計算S和H細胞的增殖抑制率。

1.4 氧化苦參堿對肉瘤S180和肝癌H22荷瘤小鼠移植瘤的影響[5]

于無菌條件下，分別將S和H瘤細胞接種于昆明種小鼠腹腔，7 d后抽取S和H荷瘤小鼠的腹水，與生理鹽水按體積比1∶4進行稀釋，配置成瘤細胞懸液，活細胞率大于95%。接種于同種異體小鼠右前肢腋皮下，每只小鼠注射0.2 mL（含2×10～4×10個），每次實驗均用同一性別。小鼠造模24 h后，將造模小鼠均衡體質量，隨機分為5組，每組10只。即模型組，氧化苦參堿高（100 mg/kg）、中（50 mg/kg）、低（25 mg/kg）劑量組，環磷酰胺（30 mg/kg）陽性對照組。另增設10只與造模組體質量相當的未接種瘤細胞懸液的小鼠作為正常對照組，各組連續8 d灌胃給藥（正常對照組和模型組灌胃等體積蒸餾水），每日1次。末次給藥后24 h，稱取小鼠體質量，頸椎脫臼處死，剝離瘤體，稱取瘤質量，計算抑瘤率。取胸腺及脾臟，稱其濕質量，計算胸腺系數和脾系數。

1.5 氧化苦參堿對S180和H22腹水型荷瘤小鼠存活時間的影響

無菌條件下，腹腔分別注射S和H瘤細胞懸液于小鼠體內，每只小鼠注射0.2 mL（含2×10～4×10個細胞），共接種50只小鼠，分成5組，每組10只，次日均衡體質量后，隨機分成模型組（蒸餾水），氧化苦參堿高（100 mg/kg）、中（50 mg/kg）、低（25 mg/kg）劑量組，環磷酰胺（30 mg/kg）陽性對照組，連續灌胃給藥8 d，每日1次。逐日記錄小鼠死亡情況，計算小鼠生命延長率。

1.6 統計學方法

2 結果

2.1 氧化苦參堿對肉瘤S180和肝癌H22細胞增殖的抑制作用

隨著劑量的增加，氧化苦參堿（OMT）對S和H細胞增殖抑制作用逐漸增強，且存在劑量-效應關系（

r

=0.67，

r

=0.59，均為

P

＜0.05）。與模型組比較，1×10和1×10g/L的氧化苦參堿對S細胞和1×10g/L的氧化苦參堿對H細胞生長的抑制率均大于30%，差異均具有統計學意義（

P

＜0.05），見表1。

表1 氧化苦參堿（OMT）對肉瘤S180和肝癌H22細胞的增殖抑制作用

2.2 氧化苦參堿對S180和H22荷瘤小鼠移植性實體瘤的影響

與模型組比較，氧化苦參堿中、低劑量組能夠顯著抑制S荷瘤小鼠腫瘤的生長，抑瘤率均＞30%，差異均具有統計學意義（

P

＜0.05）；氧化苦參堿高、中劑量組能夠顯著抑制小鼠肝癌H的生長，抑瘤率均達到30%以上，差異均具有統計學意義（

P

＜0.05），見表2和表3。

表2 氧化苦參堿（OMT）對S180荷瘤小鼠體質量和瘤質量的影響（±s，n=10）

表3 氧化苦參堿（OMT）對H22荷瘤小鼠體質量和瘤質量的影響（±s，n=10）

2.3 氧化苦參堿對S180和H22荷瘤小鼠胸腺系數和脾系數的影響

與正常組比較，氧化苦參堿各劑量組對S和H荷瘤小鼠胸腺和脾系數無明顯影響（

P

＞0.05）；環磷酰胺對照組S和H荷瘤小鼠胸腺和脾臟系數均明顯降低（

P

＜0.05），見表4。

表4 氧化苦參堿（OMT）對S180和H22荷瘤小鼠胸腺系數和脾系數的影響（±s，n=10）

2.4 氧化苦參堿對S180和H22腹水型小鼠生存期的影響

與模型組比較，氧化苦參堿中劑量組可顯著延長S腹水型小鼠的生存期，其生命延長百分率為31.18%，差異具有統計學意義（

P

＜0.05），見表5。

表5 氧化苦參堿（OMT）對S 180和H22腹水型荷瘤小鼠生存期的影響（±s，n=10）

3 討論

惡性腫瘤仍是當今威脅人類健康的主要疾病。近半個世紀以來從天然植物中提取有效成分應用于臨床惡性腫瘤治療已取得令人矚目的突破性進展，是目前惡性腫瘤綜合治療的有效手段之一。我國幅員遼闊，地處亞熱帶及溫帶，植物資源豐富，從中藥特別是我國特有植物中研究、開發抗腫瘤新藥早已成為廣大科研工作者的目標之一。

氧化苦參堿具有較為廣泛的藥理活性，為研究其抗腫瘤作用，我們以S和H荷瘤小鼠為研究對象，觀察了氧化苦參堿的體內外抗腫瘤作用。體外細胞培養實驗結果表明，與陰性對照組相比，氧化苦參堿1×10和1×10g/L兩個濃度可明顯抑制小鼠肉瘤S細胞的增殖，其抑制率均大于30%，且隨著劑量的增加，氧化苦參堿對S細胞生長的抑制作用增強，存在劑量-效應關系。為進一步明確其抗腫瘤作用，我們選取小鼠肉瘤S和肝癌H移植性腫瘤模型進行了在體動物實驗。動物移植瘤模型因具有造模時間短、接種成功率高、均一性好等特點，廣泛用于腫瘤基礎研究及藥物篩選，成為研究中醫藥抗腫瘤作用及機制的一個公認的腫瘤模型。藥物對抗腫瘤是否有效，抑瘤率是經典指標之一。與模型組相比，氧化苦參堿高、中、低3個劑量組均可明顯抑制S肉瘤小鼠腫瘤的生長，抑瘤率分別為48.48%、41.67%和32.58%；氧化苦參堿高、中劑量組可顯著抑制肝癌H小鼠腫瘤的生長，抑瘤率分別為33.95%和31.63%，抑瘤率均大于30%，符合抗癌藥篩選標準。實驗過程中我們注意到，采用氧化苦參堿治療的小鼠其飲食情況和活動情況較采用環磷酰胺治療的小鼠要好。

從氧化苦參堿對生存期的影響來看，雖然高、低劑量組可在一定程度上延長S腹水型荷瘤小鼠的生存時間，但只有中劑量組的生命延長率大于30%，其余組與空白組比較差異無統計學意義。結合抑瘤作用的結果分析，說明中劑量組的氧化苦參堿對肉瘤S腫瘤細胞的抑制作用較強，可作為將來進一步抑瘤機制研究的參考劑量。

胸腺和脾臟是動物重要的免疫器官，胸腺系數和脾系數的大小可反映機體免疫的機能狀況。氧化苦參堿給藥組胸腺和脾系數與模型組相比較，差異均無統計學意義。動物體內抗腫瘤實驗選用環磷酰胺作為陽性對照藥物，該藥物是臨床上常用的腫瘤化療藥物，抑瘤作用強大，作用機制明確，但作為一種免疫抑制劑，臨床應用時毒副作用較大。從動物體內實驗結果來看，氧化苦參堿抑瘤效果雖不及環磷酰胺，但氧化苦參堿組的小鼠生存期較環磷酰胺組小鼠的生存期稍長，且其對脾臟、胸腺系數無明顯影響，仍具有抗腫瘤作用，說明氧化苦參堿的毒性小于環磷酰胺，這正是該藥物的優勢所在。

綜上，體外和體內抗腫瘤實驗顯示，氧化苦參堿具有一定的抗腫瘤作用，尚未發現其嚴重的不良反應以及對免疫器官的影響，說明其具有潛在的臨床應用前景，苦參作為祖國傳統中藥，其資源豐富，可作為一種前景較好的抗腫瘤藥進行研究和開發，但其確切的抑瘤機制尚待進一步深入研究。