Orai1對鼻咽癌細胞侵襲和上皮-間充質轉化的影響及其機制

郭照萌，張 華，張 鵬

（深圳市龍崗區耳鼻咽喉醫院耳鼻咽喉科/深圳市耳鼻咽喉研究所，廣東 深圳 518172）

鼻咽癌是一種起源于鼻咽黏膜的上皮性癌，并表現出明顯的地理差異，70%的新發病例報告在東亞和東南亞。隨著治療技術的發展，鼻咽癌的發病率和死亡率在過去的幾十年呈下降趨勢。但是由于鼻咽癌固有的侵襲性和隱匿性，60%～70%鼻咽癌患者被診斷時已是晚期，治療效果不佳。到目前為止，對于晚期鼻咽癌尚無有效的靶向治療方法。因此探討鼻咽癌的轉移機制，尋找鼻咽癌的治療靶點具有重大意義。Orai1是鈣庫調節鈣離子內流的關鍵分子。近年研究發現在多種腫瘤中Orai1異常表達，并且對維持腫瘤細胞的黏附、增殖、侵襲等惡性表型有重要作用。然而，Orai1是否參與鼻咽癌的進展過程仍未闡明。本研究主要探討了Orai1對鼻咽癌細胞的轉移侵襲和上皮-間充質轉化（epithelial-mesenchymal transition，EMT）的影響，以期為鼻咽癌的治療提供新的靶點。

1 材料與方法

1.1 材料

RPMI-1640培養基和胎牛血清購于美國Gibco公司；重組表皮生長因子（recombinant human epidermal growth factor，rEGF）、TRIzol、Lipofectamine3000和Fluo-4 AM購于美國Invitrogen公司；Transwell小室購于美國Corning公司；Matrigel基質膠購于美國BD公司；PrimeScript?RT Reagent Kit和TB GreenFast qPCR Mix購于日本TaKaRa公司；角質形成細胞無血清培養基、Orai1抗體和Thapsigargin購于美國Sigma公司；E鈣黏蛋白（E-cadherin）抗體、N鈣黏蛋白（Ncadherin）抗體和波形蛋白（Vimentin）抗體購于美國Cell Signaling Technology公司；β肌動蛋白（β-actin）抗體購于美國Santa Cruz公司；PCR引物由上海生工合成。

1.2 方法

1.2.1 細胞培養與轉染

人鼻咽癌細胞系CNE1、CNE2、HONE1和5-8F以及人鼻咽上皮細胞系NP69保藏于深圳市耳鼻咽喉研究所。人鼻咽癌細胞系用含胎牛血清的RPMI-1640培養基，人鼻咽上皮細胞系用含rEGF的角質形成細胞無血清培養基，在CO體積分數為5%、37℃培養箱中培養。靶向Orai1的2種shRNA，Orai1 shRNA-1（5′-CGTGCACAATCTCAACT CG-3′）和Orai1 shRNA-2（5′-CCAGCATTGAGTGTGT ACA-3′），以及對照質粒（無意義序列）均由北京協和藥物所王艷博士饋贈。應用Lipofectamine3000試劑進行質粒轉染。

1.2.2 實時熒光定量PCR

TRIzol提取細胞總RNA，然后用PrimeScript?RT Reagent Kit轉錄得到cDNA，再進行實時定量PCR：95℃、5 min；95℃、60 s，60℃、30 s，72℃、30 s，共進行35個循環。引物序列：Orai1上游5′-GCCCTTCGGCCTGATCTTTAT-3′，下游5′-TGGAACTGTCGGTCAGTCTTAT-3′；E-cadherin上 游5′-GCCTCCTGAAAAGAGAGTGGAAG-3′，下游5′-TGGCAGTGTCTCTCCAAATCCG-3′；N-cadherin上游5′-CCTCCAGAGTTTACTGCCATGAC-3′，下游5′-GTAGGATCTCCGCCACTGATTC-3′；Vimentin上游5′-AGGCAAAGCAGGAGTCCACTGA-3′，下 游5′-ATC TGGCGTTCCAGGGACTCAT-3′；ACTB上游5′-CACC ATTGGCAATGAGCGGTTC-3′，下游5′-AGGTCTTTG CGGATGTCCACGT-3′。以ACTB為內參，采用2法計算相對表達水平。

1.2.3 Western blot

分別提取細胞總蛋白，采用BCA蛋白試劑盒檢測蛋白含量。取適量蛋白加入上樣緩沖液，100℃煮沸10 min。以每泳道20μg總蛋白進行SDS-PAGE電泳，80 V、30 min，120 V、100min。電泳后將蛋白轉至PVDF膜，100 V、90 min。電轉后PVDF膜用5%BSA室溫孵育60 min，孵育相應蛋白的抗體，置于4℃冰箱內搖床過夜。翌日TBST洗滌PVDF膜3次后，加入相應HRP標記的二抗室溫孵育120 min，TBST洗滌PVDF膜3次后，加入ECL顯影液，進行化學發光。

1.2.4 鈣庫調節的鈣離子內流檢測

為明確Orai1的表達變化對鼻咽癌細胞鈣庫調節鈣離子內流的影響，采用轉染Orai1 shRNA和對照shRNA后檢測鈣庫調節鈣離子的內流。操作步驟為：用臺式液配制的4μmol/L Fluo-4 AM于培養箱中避光孵育細胞30 min，臺氏液洗滌3次后，用無鈣離子的臺氏液配制的4μmol/L thapsigargin孵育細胞15 min，加入2 mmol/L鈣離子觀察鈣離子內流。Fluo-4熒光信號用激光共聚焦顯微鏡觀察。

1.2.5 Transwell轉移實驗

在24孔細胞培養板中加入含10%胎牛血清的RPMI-1640培養基，置入Transwell小室，取1×10/mL細胞懸液200μL接種在Transwell小室上層，然后置于37℃培養箱中培養，16 h后取出Transwell小室，用棉簽去除小室上層未轉移的細胞，然后在4%多聚甲醛中固定15 min。再將小室置于結晶紫染液中染色，拍照。

1.2.6 Transwell侵襲實驗

Matrigel與RPMI-1640培養基按1∶8體積比稀釋后包被Transwell小室上層，然后置于37℃培養箱中30 min。后續操作同1.2.5。

1.2.7 EMT標志蛋白的檢測

EMT可促進癌細胞失去細胞極性和細胞間黏附，導致細胞脫離、遷移和侵襲。為明確Orai1是否影響鼻咽癌細胞EMT，應用實時熒光定量PCR和Western blot方法檢測轉染Orai1shRNA和對照shRNA后CNE2細胞中EMT標志蛋白Ecadherin、N-cadherin和Vimentin mRNA和蛋白的表達水平，具體操作方法同1.2.2和1.2.3。

1.3 數據分析

2 結果

2.1 Orai1 shRNA轉染前后細胞中Orai1的表達水平

結果表明（圖1），Orai1在鼻咽癌細胞系及鼻咽上皮細胞中均有表達，且CNE2細胞系中Orai1的mRNA和蛋白表達水平較NP69細胞均顯著升高（

P

＜0.05），因此，后續實驗選擇CNE2細胞進行。

圖1 Orai1 mRNA和蛋白在鼻咽細胞中的表達

CNE2細胞轉染Orai1 shRNA后，采用qPCR和Western blot方法檢測Orai1的mRNA和蛋白表達水平，見圖2。結果表明，與轉染對照shRNA的細胞相比，轉染Orai1 shRNA的細胞中Orai1的mRNA和蛋白表達水平均顯著下降，差異均具有統計學意義（

P

＜0.05）。Orai1 shRNA-1與Orai1 shRNA-2效果相似，后續選擇Orai1 shRNA-1進行轉染（EMT實驗除外）。

圖2 敲減CNE2細胞中Orai1的表達

2.2 Orai1對鼻咽癌細胞鈣庫調節鈣離子內流的影響

結果表明，敲減Orai1的表達后可顯著降低鈣庫調節鈣離子內流的能力，差異有統計學意義（

P

＜0.05），見圖3。此結果表明降低Orai1的表達可顯著抑制鼻咽癌細胞鈣庫調節的鈣離子內流。

圖3 敲減Orai1表達后對CNE2細胞鈣庫調節的鈣內流的影響

2.3 Orai1對鼻咽癌細胞轉移和侵襲能力的影響

Transwell轉移實驗結果見圖4，與轉染對照shRNA組相比，轉染Orai1 shRNA的CNE2細胞轉移數量顯著降低（

P

＜0.05）。另外，我們采用加入了Matrigel的Transwell侵襲實驗檢測細胞侵襲能力。結果發現，與轉染對照shRNA組相比，CNE2細胞轉染Orai1 shRNA后細胞侵襲能力顯著被抑制，差異有統計學意義（

P

＜0.05），見圖5。

圖4 敲減Orai1表達后對CNE2細胞轉移的影響

圖5 敲減Orai1表達后對CNE2細胞侵襲的影響

2.4 Orai1對鼻咽癌細胞EMT的影響

結果如圖6所示，CNE2細胞轉染Orai1 shRNA-1和-2均可顯著抑制N-cadherin、Vimentin的mRNA和蛋白表達水平（

P

＜0.05），增加E-cadherin的mRNA和蛋白表達水平（

P

＜0.05）。提示降低Orai1的表達可顯著抑制鼻咽癌細胞的EMT。

圖6 敲減Orai1表達后對CNE2細胞EMT的影響

3 討論

鼻咽癌的病因包括遺傳因素、環境因素和EB病毒感染等。雖然放射治療和化學治療是鼻咽癌強有力的治療策略，但大多數鼻咽癌患者在早期診斷時已發生轉移，阻礙了有效治療，導致復發頻繁。因此，加深對鼻咽癌發病機制的理解有助于發掘新型轉移靶向治療，改善鼻咽癌患者的預后。雖然Orai1被認為是腫瘤細胞轉移的重要因素，但其在鼻咽癌細胞中的作用機制尚不清楚。本研究證實Orai1影響鼻咽癌細胞的轉移侵襲，并可能與EMT相關。因此，研究Orai1調控鼻咽癌細胞轉移的分子機制，將為早期干預鼻咽癌轉移提供新的方向。

雖然近年來對腫瘤轉移的認識有了較大的進展，但鈣離子在腫瘤轉移中的作用仍不清楚。鈣離子是一種多功能的第二信使，調節細胞的許多生理和病理過程。鈣離子通過鈣調素或其他鈣結合蛋白調節細胞內酶活性和蛋白間的相互作用。鈣庫調節的鈣離子內流（store-operated Caentry，SOCE）是鈣離子進入非興奮性細胞的主要方式之一。Orai1是一種位于細胞膜上的鈣通道蛋白，在哺乳動物細胞調控SOCE中發揮重要作用。當內質網中的鈣儲存耗盡后，會激活Orai1，使鈣離子快速而短暫地流入細胞質。Orai1作為SOCE的重要組成部分，研究表明Orai1促進黑色素瘤、乳腺癌和腸癌細胞的轉移，我們前期的研究亦表明Orai1在缺氧微環境下通過調節SOCE促進乳腺癌的遷移。Orai1在多種腫瘤中高表達，包括非小細胞肺癌、食管癌和胃癌。我們的研究結果與之前的報道一致，在本研究中發現Orai1在鼻咽癌細胞CNE1、CNE2、HONE1和5-8F中的表達明顯高于人鼻咽上皮細胞NP69。這些結果提示Orai1可能參與了鼻咽癌的發生發展。最近的研究表明，SOCE在各種惡性腫瘤進展中起著重要作用。為了驗證Orai1在鼻咽癌細胞中調控SOCE的作用，我們選擇靶向Orai1的特異性shRNA降低Orai1在CNE2細胞中的表達。進一步研究發現，敲減Orai1的表達可以顯著抑制鼻咽癌細胞鈣庫調節的鈣離子內流。提示Orai1可能是調控鼻咽癌細胞惡性發展的關鍵因子，并且在鼻咽癌細胞中正向調控SOCE。為了證實Orai1調控鼻咽癌細胞侵襲的作用，我們通過轉染Orai1 shRNA抑制鼻咽癌細胞中Orai1表達后，發現鼻咽癌細胞的轉移和侵襲受到抑制，說明抑制Orai1表達可抑制鼻咽癌細胞的轉移和侵襲，提示Orai1可能通過SOCE調節鼻咽癌細胞的轉移和侵襲。

鼻咽癌的死亡率主要是由于腫瘤細胞從原發腫瘤向局部淋巴及遠處器官的侵襲和轉移。多數實體癌起源于上皮細胞，上皮-間充質轉化（epithelialmesenchymal transition，EMT）被認為是上皮細胞獲得運動能力的重要過程。盡管EMT最初是在胚胎發育期間被發現，但越來越多的研究表明EMT可導致間質細胞標記物的獲得和上皮標記物的丟失，進而增強癌細胞的遷移和侵襲能力，促進腫瘤的進展。研究表明，E-cadherin調控細胞黏附，低表達E-cadherin促進細胞脫離原位點，相反，N-cadherin和Vimentin與腫瘤侵襲性增加呈正相關，而這一過程已被證明與鈣離子內流有關。鈣離子作為第二信使通過影響各種基因、蛋白質和信號通路調節細胞多種功能。相關研究已經證實多種類型的癌細胞中鈣離子通道和參與鈣離子穩態的分子具有顯著的表達失調。研究顯示，Orai1在胃癌細胞中表達升高，降低Orai1可抑制胃癌細胞EMT和轉移。降低前列腺癌PC-3細胞的Orai1表達，可顯著抑制EMT以及細胞運動、遷移及侵襲能力。但是Orai1在鼻咽癌細胞EMT相關的轉移中是否發揮作用，依然不明確。本研究得到了相似的結果，在鼻咽癌細胞CNE2中降低Orai1的表達后，E-cadherin的表達降低，而N-cadherin和Vimentin的表達升高，抑制鼻咽癌細胞EMT。本研究結果提示降低Orai1表達可能通過抑制EMT過程，阻礙鼻咽癌細胞的轉移和侵襲。

綜上所述，鼻咽癌細胞中Orai1呈高表達，降低Orai1表達可抑制鼻咽癌細胞的轉移和侵襲，其可能通過負調控SOCE和EMT發揮作用。因此，深入研究Orai1在鼻咽癌細胞轉移中的分子機制，有望發掘鼻咽癌靶向治療的新靶點。