乳腺癌中miR-221、miR-222表達水平對GATA3和FOXA1蛋白的影響及其作用機制

方煜彤，張群琛，洪超群，陳春發，陳炯玉，張任棟，吳俊東，

（1．汕頭大學醫學院附屬腫瘤醫院乳腺中心，廣東 汕頭 515041；2．汕頭大學醫學院附屬腫瘤醫院中心實驗室，廣東 汕頭 515041；3．廣東省乳腺癌診治研究重點實驗室，廣東 汕頭 515041）

miR-221和miR-222（miR-221/222）均為小分子非編碼RNA，能在轉錄后水平調控靶基因mRNA的翻譯，調節蛋白質的合成，兩者均定位于X染色體，位點相差約1 kb，擁有相同的轉錄本和種子序列，具有高度同源性。最近的研究證實，miR-221/222的異常表達與多種惡性腫瘤的發生發展密切相關。在乳腺癌中，miR-221/222在侵襲性較低的雌激素受體-α（estrogen receptor-α，ER-α）陽性乳腺癌細胞中呈低表達，而在高侵襲性ER-α陰性的基底樣乳腺癌細胞呈高表達。GATA結合蛋白3（GATA binding protein 3，GATA3）和叉頭框蛋白A1（fork head box protein A1，FOXA1）均為轉錄因子，其表達與乳腺管腔上皮細胞的發生和維持分化，以及ER-α及孕激素受體（progesterone receptor，PR）的表達密切相關。乳腺癌中miR-221/222水平與GATA3及FOXA1表達的相關性及可能的作用機制鮮見報道，因此，本研究通過莖環引物實時熒光定量PCR（quantitative real-time PCR，qPCR）技術及免疫組化方法分別檢測了86例乳腺浸潤性導管癌組織中miR-221/222水平與GATA3和FOXA1蛋白的表達，分析它們的相關性及臨床意義；并在5種乳腺癌細胞系（MCF-7、T47D、SKBR3、MDA-MB-231和BT-549）中轉染miR-221/222 mimics后，采用qPCR檢測各細胞中miR-221/222的表達水平；采用Western blot檢測轉染后MCF-7細胞中GATA3、FOXA1、雌激素受體-α（ER-α）和鈣黏蛋白E（E-cadherin）的表達；用細胞劃痕和遷移侵襲實驗檢測轉染后MCF-7細胞修復和遷移侵襲能力。從細胞水平探討miR-221/222對GATA3和FOXA1蛋白表達的調控機制。

1 材料與方法

1.1 病例和標本

收集汕頭大學醫學院附屬腫瘤醫院2020年1月—2021年5月經手術切除的86例乳腺浸潤性導管癌及其癌旁組織標本，排除有遠處轉移的乳腺癌患者。患者均為女性，臨床病理資料完整，年齡37～71歲，中位年齡53歲；其中16例患者接受新輔助治療后手術，70例患者初始手術治療；根據第8版《AJCC癌癥分期手冊》，TNM分期Ⅰ期21例、Ⅱ期57例、Ⅲ期8例。乳腺癌組織標本取自癌灶中央組織，癌旁組織取距腫瘤邊緣2 cm以外的乳腺組織。PCR檢測組織采集后加入1 mL RNA later于-80℃保存；免疫組化檢測組織用福爾馬林固定、石蠟包埋，并切成4μm的切片組織。

1.2 細胞培養與分組轉染

5種乳腺癌細胞系MCF-7、T47D、SKBR3、MDA-MB-231和BT-549均購自上海中國科學院典型培養物保藏委員會細胞庫，分別培養于含10%胎牛血清、100 U/mL青霉素、100 mg/L鏈霉素的DMEM培養基中，置于37℃、CO體積分數為5%恒溫箱中培養，根據細胞生長情況隔天更換培養基，3～4 d傳代。取對數生長期的細胞接種于6孔板中，置于37℃培養箱中繼續培養。當MCF-7細胞生長至鋪滿50%孔底面積時按照Lipofectamine 2000轉染試劑（購自Invitrogen公司）說明書轉染miR-221/222模擬物（miR-221/222 mimics購自中國上海吉瑪制藥技術有限公司）作為實驗組，設未轉染的MCF-7細胞為陰性對照組。

1.3 RNA提取

細胞和組織RNA提取均按照RNA提取試劑盒（北京天根生化科技公司）說明書進行。在細胞培養板中加入1 mL的TRIzol試劑，用取樣器抽打若干次至溶液透明；組織標本則為取-80℃保存的標本加入1 mL的TRIzol試劑，通過冷凍型高通量組織研磨器（寧波新芝生物科技公司）進行研磨裂解處理。經氯仿振蕩離心，異丙醇沉淀，75%乙醇充分漂洗，加入20μL DEPC水溶解。采用NANODROP 2000分光光度儀（賽默飛公司）測定RNA的濃度及純度，其中

D

（260）/

D

（280）在1.8～2.2為合格，可用于后續實驗。

1.4 qPCR檢測組織和細胞miR-221/222的相對表達

采用莖環引物qPCR檢測5種乳腺癌細胞系、轉染miR-221/222 mimics的MCF-7細胞、乳腺癌組織及其配對癌旁組織中miR-221/222的表達水平。逆轉錄和PCR反應均按照PrimeScript試劑盒（大連寶生物工程有限公司）說明書進行，引物均由上海生工公司設計并合成，引物序列見表1。取500 ng總RNA以miR-221/222莖環RT引物1μL進行逆轉錄；逆轉錄的反應條件為37℃、15 min，85℃、5 s，4℃保持，反應結束后-20℃保存。使用CFX96熒光定量PCR儀（美國伯樂公司）進行擴增，每個樣品重復3次，反應體系10 μL，反應條件：95℃、30 s；95℃、5 s，60℃、30 s，40個循環，最后72℃延伸。以U6為內參，采用相對定量法計算，以2法計算miR-221/222的相對表達水平。

表1 引物序列

1.5 免疫組化及結果判定

取石蠟切片，置于60℃溫箱中孵育30 min，然后置于二甲苯中脫蠟，梯度乙醇復水。用EDTA抗原修復液進行抗原修復，冷卻至室溫后，用PBS漂洗切片，0.3%的HO孵育20 min以阻斷內源性過氧化物酶活性。然后用羊血清封閉液處理30 min，分別加入GATA3、FOXA1一抗（美國Abcam公司，均按1∶1 000稀釋）后4℃孵育過夜。次日，待切片恢復室溫，用PBS漂洗，在37℃培養箱中孵化二抗酶標羊抗鼠/兔IgG聚合物（中國上海基因科技公司）30 min。配制DAB顯色試劑，顯微鏡下控制顯影程度，用PBS漂洗，蘇木素染色細胞核。清水漂洗后，切片置于梯度酒精和二甲苯中脫水，自然風干后用中性樹膠封片。

所有染色切片均由兩名資深病理科醫師用雙盲法獨立重復閱片，以PBS代替一抗作為陰性對照，相同條件下已知陽性片作為陽性對照。GATA3和FOXA1著色部位主要在細胞核，以細胞核出現黃色或棕黃色顆粒為陽性反應，采用強度和數量積分相乘的方法進行評價。強度評分為陰性（0分）；弱陽性，淺棕色（1分）；中度陽性，棕色（2分）；強陽性，深棕色（3分）。量化評分為陰性（0分）；＜25%（1分）；25%（含）～50%（2分）；50%（含）～75%（3分）；≥75%（4分）。總分：0分陰性（-）；1～4分弱陽性（+）；5～8分陽性（++）；≥9分強陽性（+++）。-和+為低表達，++和+++為高表達。

1.6 Western blot檢測蛋白的表達

采用Western blot檢測對照組和轉染后的MCF-7細胞中GATA3、FOXA1、ER-α、E-Cadherin的表達情況，以GAPDH為內參。收集細胞樣品，加入預冷的裂解液于冰上充分裂解約30 min。將裂解液移至1.5 mL離心管中，4℃、12 000 r/min離心10 min，吸取上清液于1.5 mL離心管-80℃保存，BCA試劑盒（大連寶生物工程有限公司）檢測蛋白濃度。經10%聚丙烯酰胺凝膠電泳分離后，4℃下100 V恒壓轉膜2 h，5%脫脂奶粉中封閉非特異性抗原 1 h，分別加入GATA3或FOXA1一抗（均為美國Abcam公司，1∶1 000稀釋）、ER-α一抗（北京GeneTeX公司，1∶1 500稀釋）、E-cadherin一抗（北京GeneTeX公司，1∶2 000稀釋）、GAPDH一抗（美國Abcam公司，1∶10 000稀釋）后4℃孵育過夜。次日，加入相應二抗（美國CST公司，1∶2 000稀釋），室溫孵育1 h，ECL顯影，化學發光成像儀曝光。

1.7 劃痕實驗

實驗組和對照組處理同1.2，兩組MCF-7細胞分別用胰蛋白酶消化后重懸計數，鋪在6孔板中，每孔取2×10個細胞（孔板底部背面提前用marker筆和直尺劃線，每個孔均勻劃5條間隔相等的線）；等細胞生長到大約鋪滿90%孔底面積時，用100μL的槍頭沿著6孔板背面線垂直劃線，每次保持相同的力度，用PBS水輕輕洗3遍，去除劃下的漂浮細胞，加入無血清培養基，劃痕0、48 h后通過計算每個視野的劃痕面積來觀察細胞修復能力。

1.8 細胞遷移和侵襲實驗

分組同1.2，兩組MCF-7細胞在無血清的DMEM培養基饑餓處理12 h后分別用胰蛋白酶消化后重懸計數，取500μL（約2×10個細胞）細胞懸液加至8μm的Transwell小室（購自美國BD公司），下室為含10%FBS的培養基。侵襲實驗則用含Matrigel的小室（購自美國BD公司）替代Transwell小室。繼續培養48 h，用甲醛固定后以0.1%結晶紫染色，用棉簽輕輕擦掉上層未遷移細胞，計算5個高倍鏡視野（400倍）平均細胞數目。

1.9 統計學方法

2 結果

2.1 miR-221/222在乳腺癌組織中的表達水平及其與GATA3、FOXA1等表達的相關性

miR-221/222在乳腺癌中的表達水平均明顯高于相應癌旁乳腺組織，差異均具有統計學意義（

P

=0.00）；miR-221/222表 達 水 平 在FOXA1、GATA3、ER-α及PR陰性表達組均顯著高于陽性表達組（

P

＜0.01），見表2、圖1。

表2 乳腺癌組織中miR-221/222表達水平與臨床病理指標的相關性

圖1 GATA3和FOXA1在乳腺癌中的表達

2.2 miR-221/222、GATA3、FOXA1表達水平與臨床病理指標的相關性

miR-221/222的表達水平在高增殖指數組（Ki-67高表達）、Her-2陽性表達、三陰性分子亞型顯著高于低Ki-67、Her-2陰性表達、luminal A及luminal B1型乳腺癌（

P

＜0.05）；miR-221/222的表達水平與患者的年齡、月經狀況、腫塊大小、淋巴結轉移、組織學分級及TNM分期無明顯相關關系（

P

＞0.05），而GATA3、FOXA1高表達與ER-α及PR陽性、luminal分子亞型相關（

P

＜0.05），見表2和表3。

表3 乳腺癌組織中GATA3和FOXA1表達與臨床病理特征的相關性

2.3 乳腺癌細胞系中miR-221/222的表達及轉染模擬物后對相關蛋白的影響

5種乳腺癌細胞系MCF-7、T47D、SKBR3、MDA-MB-231、BT-549中miR-221/222的表達情況見圖2A，可見miR-221/222在MCF-7細胞中均低表達，故選擇MCF-7細胞進行后續實驗。在MCF-7細胞中瞬時轉染miR-221/222 mimics后miR-221/222表達較陰性對照組顯著升高（

P

＜0.05，圖2B），且內源性的GATA3和FOXA1蛋白表達被抑制，上皮細胞相關的分子ER-α和E-cadherin表達也出現下降（圖2C）。

圖2 乳腺癌細胞系中miR-221/222的表達及其對相關蛋白的影響

2.4 轉染miR-221/222模擬物后對MCF-7細胞修復、遷徙和侵襲能力的影響

與陰性對照組相比，MCF-7轉染miR-221/222 mimics后，高表達miR-221/222的MCF-7細胞修復、遷移和侵襲能力均顯著增強，差異均具有統計學意義（

P

＜0.01，圖3）。

圖3 轉染miR-221/222 mimics后MCF-7細胞修復、遷移和侵襲能力的變化

3 討論

近年的研究顯示miR-221和/或miR-222在眾多惡性腫瘤如肝細胞癌、胰腺癌、前列腺癌、乳腺癌、結直腸癌和腦膠質細胞瘤等癌組織或癌細胞中的表達水平明顯高于相應的癌旁正常組織或正常細胞。在本研究中，乳腺浸潤性導管癌組織的miR-221/222也顯著高于癌旁組織，與文獻[11-12]報道結果一致。miR-221/222在惡性腫瘤中水平的異常增高可能通過其與靶基因mRNA的3′-UTR區互補結合，在轉錄后水平調控靶基因的表達，通過信號激活、細胞增殖、分化、凋亡、血管生成機制，在惡性腫瘤的發生、發展，以及侵襲遷移過程中起重要作用。

GATA3是鋅指DNA結合蛋白GATA家族的成員，在乳腺癌中與ER-α的表達相關，特別是在腔內亞型（luminal）中，GATA3是調節乳腺形態發生和腔內細胞分化的必需因子。在本研究中，GATA3在ER-α/PR陽性的luminal亞型乳腺癌中的表達顯著高于ER-α/PR陰性乳腺癌，與文獻報道一致，GATA3蛋白的高表達與luminal亞型乳腺癌分化好、低侵襲和預后好相關。FOXA1是叉頭轉錄因子家族的一員，也已被確定為ER-α相關調控通路的關鍵元件，其高表達與ER-α陽性預后好的luminal亞型乳腺癌相關，本研究結果亦顯示FOXA1的高表達與ER-α/PR陽性的luminal亞型乳腺癌顯著相關。GATA3和FOXA1均與雌激素受體表達相關，GATA3/FOXA1/ER-α網絡是ER-α發揮功能的必需因子。而本研究在乳腺癌組織中的miR-221/222水平升高與GATA3、FOXA1的低表達以及ER-α/PR陰性表達顯著相關。另外本研究在細胞水平也顯示轉染miR-221/222模擬物后引起GATA3、FOXA1和ERα的表達下降，提示miR-221/222對GATA3、FOXA1以及ER-α表達可能有負性調節作用。而最近的研究也發現，在乳腺癌中miR-221/222的過表達可下調ER-α的表達，而下調miR-221/222可以部分恢復ER-α的表達和對他莫昔芬的敏感性，抑制miR-221/222可以增加ER-α陽性的MCF-7細胞對他莫昔芬的敏感性。miR-221/222對GATA3、FOXA1、ER-α以及PR表達的負性調節作用及機制仍需進一步研究證實，抑制miR-221/222的表達有可能成為逆轉臨床上內分泌耐藥的潛在治療靶點。

本研究結果還表明miR-221/222的表達水平在高增殖指數組（Ki-67高表達）、三陰性和Her-2陽性表達分子亞型乳腺癌組織中顯著高于低Ki-67、luminal A及luminal B1型乳腺癌。文獻[22-23]報道miR-221/222在高侵襲性三陰性乳腺癌中顯著高表達，其通過下調細胞因子信號轉導抑制因子1和周期蛋白依賴性激酶抑制因子1B促進癌細胞進入S期，并通過靶向磷酸酶和張力蛋白同源物/蛋白激酶B（PTEN/Akt）通路促進乳腺癌干細胞的自我更新，從而增強了乳腺癌細胞的生長、遷移和侵襲能力。本研究發現，轉染了miR-221/222模擬物的MCF-7乳腺癌細胞，其劃痕修復能力和遷移侵襲能力均顯著增強。另本研究結果顯示，miR-221/222的表達水平在Her-2陽性表達分子亞型乳腺癌中顯著升高，這與Miller等研究結果一致。在Her-2陽性乳腺癌細胞中，miR-221/222高表達水平可通過多種途徑促進乳腺癌的侵襲性，Her-2還通過miR-221/222誘導ESR1下調，誘導乳腺癌細胞對內分泌治療的耐藥性。

綜上所述，乳腺癌組織中miR-221/222表達水平較癌旁正常乳腺組織表達明顯上調，與Her-2陽性表達、三陰性乳腺癌亞型和Ki-67高表達顯著相關。乳腺癌細胞中miR-221/222高表達則GATA3和FOXA1蛋白表達被抑制，且ER-α和E-cadherin表達明顯下降，劃痕修復能力和遷移侵襲能力均明顯增強。miR-221/222可能通過下調GATA3、FOXA1、ER-α的表達促進乳腺癌的生長、遷移和侵襲，miR-221/222可能成為乳腺癌預后判斷的潛在標志物和抑制侵襲轉移的潛在治療靶點。