青藤堿對(duì)HPV陽性宮頸癌SiHa細(xì)胞增殖和侵襲的影響

王曉舟，李洪石，于 溪，魏 寧，王梓瑛，赫麗杰

（遼寧省人民醫(yī)院腫瘤一科/放療科，遼寧 沈陽 110016）

【關(guān)鍵字】HPV陽性宮頸癌；SiHa細(xì)胞；增殖；侵襲

宮頸癌是一種常見的婦科惡性腫瘤，通常指宮頸陰道部或移行帶處的鱗狀上皮細(xì)胞以及宮頸管內(nèi)膜處的柱狀上皮細(xì)胞交界處發(fā)生惡性癌變。目前，宮頸癌的發(fā)病率僅次于乳腺癌，并且呈年輕化趨勢(shì)。研究發(fā)現(xiàn)，宮頸癌患者中大多數(shù)能檢測(cè)到人乳頭瘤病毒（human papilloma virus，HPV）感染，宮頸癌的發(fā)病也與HPV持續(xù)感染有關(guān)，并且HPV與宮頸癌的復(fù)發(fā)轉(zhuǎn)移和生存有一定的相關(guān)性。宮頸癌的治療手段以手術(shù)為主，但是有些患者的病情特殊，需要先進(jìn)行化療，為手術(shù)治療提供可能。但是目前仍缺乏有效治療宮頸癌的特異性藥物，因此尋找有效的抗宮頸癌藥物成為目前的研究重點(diǎn)。

青藤堿（sinomenine，SIN）是一種從防己科植物青藤及毛青藤的藤莖中提取的生物堿。研究發(fā)現(xiàn)青藤堿具有顯著的抗氧化、免疫抑制以及抗血管生成等作用。近年來有研究報(bào)道青藤堿抗腫瘤作用也尤為顯著，青藤堿可抑制腫瘤細(xì)胞的生長和遷移能力。但是關(guān)于青藤堿是否能夠抑制宮頸癌細(xì)胞的增殖和侵襲方面的研究較少，因此本研究采用青藤堿干預(yù)HPV陽性宮頸癌細(xì)胞系SiHa細(xì)胞，探討青藤堿對(duì)SiHa細(xì)胞增殖和侵襲的影響。

1 材料與方法

1.1 試劑與儀器

HPV陽性宮頸癌細(xì)胞株SiHa購自上海信裕生物技術(shù)有限公司；青藤堿購自成都德思特生物技術(shù)有限公司；RPMI 1640培養(yǎng)基，胎牛血清，Tryple Express均購自美國Gibco公司；CCK-8試劑盒購自碧云天生物技術(shù)研究所；Matrigel膠購自美國BD公司；吉姆薩染色液試劑盒購自北京索萊寶科技有限公司。超凈工作臺(tái)和二氧化碳恒溫箱購自賽默飛世爾科技（中國）有限公司；顯微鏡購自德國Leica公司。

1.2 方法

1.2.1 SiHa細(xì)胞培養(yǎng)

SiHa細(xì)胞使用含10%胎牛血清的RPMI-1640細(xì)胞培養(yǎng)液，置于37℃、CO體積分?jǐn)?shù)為5%、95%濕度的培養(yǎng)箱中培養(yǎng)。每2 d換液1次，每3 d傳代1次。

1.2.2 采用CCK-8法檢測(cè)細(xì)胞增殖能力

取對(duì)數(shù)生長期細(xì)胞，以按每孔4×10個(gè)接種于96孔板中，每孔200μL培養(yǎng)液。根據(jù)參考文獻(xiàn)分別將終濃度為0.2、0.4和0.8 mmol/L的青藤堿添加到SiHa細(xì)胞培養(yǎng)液中，陰性對(duì)照組細(xì)胞未加青藤堿。各組均設(shè)5個(gè)復(fù)孔，分別作用24和48 h后進(jìn)行檢測(cè)，每孔加入20μL的CCK-8，培養(yǎng)3 h，吸取上清進(jìn)行檢測(cè)，酶標(biāo)儀檢測(cè)450 nm波長處的吸光度，并計(jì)算細(xì)胞存活率。

1.2.3 免疫熒光法檢測(cè)Ki67陽性細(xì)胞數(shù)

作為細(xì)胞增殖的標(biāo)記物，Ki67在細(xì)胞增殖的各期中均有表達(dá)，因此應(yīng)用免疫熒光法檢測(cè)Ki67陽性細(xì)胞數(shù)分析細(xì)胞的增殖能力。取對(duì)數(shù)生長期細(xì)胞，按每孔1×10個(gè)接種于預(yù)先鋪有玻片的24孔板內(nèi)制作細(xì)胞爬片。青藤堿處理組采用終濃度為0.2 mmol/L的青藤堿，陰性對(duì)照組細(xì)胞未加青藤堿。給藥24 h后，將細(xì)胞爬片取出，4%多聚甲醛固定30 min，細(xì)胞透膜液滲透10 min，封閉液封閉1 h，鼠抗人Ki67一抗（1∶200稀釋）濕盒4℃過夜。第2天，加入TRITC標(biāo)記羊抗鼠二抗（1∶1 000稀釋）濕盒室溫孵育2 h，DAPI（1∶200稀釋）孵育10 min，甘油封片，熒光顯微鏡檢測(cè)。

1.2.4 Transwell實(shí)驗(yàn)檢測(cè)細(xì)胞侵襲能力

先將Matrigel膠鋪在Transwel小室的上室中，待膠凝固。將細(xì)胞用無血清培養(yǎng)基制成細(xì)胞懸液，調(diào)整細(xì)胞濃度為1×10個(gè)/mL，取200μL細(xì)胞懸液接種在每孔的上室中，下室加入500μL含10%FBS的培養(yǎng)液，青藤堿處理組在上室中加入終濃度為0.2 mmol/L的青藤堿，陰性對(duì)照組細(xì)胞未加青藤堿，作用24 h后將Transwell小室上室進(jìn)行吉姆薩染色，干燥后對(duì)其進(jìn)行拍照并計(jì)算穿膜細(xì)胞數(shù)。

1.2.5 Western blot法檢測(cè)MMP-2和MMP-9的蛋白表達(dá)

青藤堿處理組在細(xì)胞培養(yǎng)液中加入終濃度為0.2 mmol/L的青藤堿，陰性對(duì)照組細(xì)胞未加青藤堿，作用24 h后收集SiHa細(xì)胞，提取總蛋白。將樣品加入SDS-PAGE膠樣品孔中，電泳，轉(zhuǎn)膜，封閉液封閉2 h，分別加入MMP-2和MMP-9（1∶2 000稀釋）一抗4℃孵育過夜，HRP標(biāo)記的羊抗兔二抗（1∶10 000稀釋）室溫孵育2 h，ECL發(fā)光液進(jìn)行反應(yīng)1 min，拍照，檢測(cè)條帶吸光度值，并計(jì)算蛋白相對(duì)表達(dá)水平。

1.3 統(tǒng)計(jì)分析

所有數(shù)據(jù)采用SPSS 22.0軟件進(jìn)行分析。以均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)差表示，陰性對(duì)照組和不同濃度青藤堿處理組細(xì)胞活力的差異分析采用單因素方差分析，Ki67陽性細(xì)胞數(shù)、侵襲細(xì)胞數(shù)，以及MMP2、MMP9蛋白表達(dá)水平差異的分析采用獨(dú)立樣本

t

檢驗(yàn)。以

P

＜0.05為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 青藤堿對(duì)HPV陽性宮頸癌SiHa細(xì)胞增殖能力的影響

CCK-8和免疫熒光實(shí)驗(yàn)結(jié)果見圖1。0.2、0.4和0.8 mmol/L青藤堿作用SiHa細(xì)胞24和48 h后，SiHa細(xì)胞的增殖能力均明顯低于對(duì)照組（

P

＜0.01）。選取對(duì)SiHa細(xì)胞產(chǎn)生抑制作用的最低濃度0.2 mmol/L作用24 h為后續(xù)實(shí)驗(yàn)的青藤堿濃度和作用時(shí)間。結(jié)果還發(fā)現(xiàn)，青藤堿處理組SiHa細(xì)胞中Ki67陽性細(xì)胞數(shù)減少（

P

＜0.01）。進(jìn)一步證實(shí)青藤堿可以降低HPV陽性宮頸癌SiHa細(xì)胞的增殖能力。

圖1 CCK-8法和免疫熒光法分析青藤堿對(duì)SiHa細(xì)胞增殖的作用

2.2 青藤堿對(duì)HPV陽性宮頸癌SiHa細(xì)胞侵襲能力的影響

Transwell侵襲實(shí)驗(yàn)結(jié)果見圖2。與對(duì)照組相比，青藤堿處理組發(fā)生侵襲的SiHa細(xì)胞數(shù)減少（

P

＜0.01），結(jié)果證實(shí)0.2 mmol/L青藤堿可抑制HPV陽性宮頸癌SiHa細(xì)胞的侵襲能力。

圖2 Transwell侵襲實(shí)驗(yàn)分析青藤堿抑制SiHa細(xì)胞的侵襲能力

2.3 青藤堿對(duì)HPV陽性宮頸癌SiHa細(xì)胞MMP-2和MMP-9蛋白表達(dá)的影響

Western blot實(shí)驗(yàn)結(jié)果見圖3。與對(duì)照組相比，青藤堿處理組MMP-2和MMP-9蛋白的表達(dá)水平均降低（

P

＜0.01）。結(jié)果證實(shí)青藤堿可能通過降低MMP-2和MMP-9蛋白表達(dá)影響HPV陽性宮頸癌SiHa細(xì)胞的侵襲能力。

圖3 Western blot法檢測(cè)青藤堿對(duì)SiHa細(xì)胞MMP-2和MMP-9蛋白表達(dá)的影響

3 討論

HPV與宮頸癌高度相關(guān)，是一個(gè)重要的致癌因子。HPV擁有120多種亞型，其中高危亞型HPV16與宮頸癌的發(fā)生密切相關(guān)。持續(xù)感染高危型HPV會(huì)導(dǎo)致局部細(xì)胞免疫能力降低，加重患者陰道微生態(tài)紊亂，促進(jìn)宮頸癌的發(fā)生發(fā)展。因此近年來尋求高效低毒的抗腫瘤活性成分已成為獲取新型抗腫瘤藥物的重要途徑之一。

青藤堿具有抗炎、鎮(zhèn)痛、鎮(zhèn)咳、降壓等藥理作用，主要應(yīng)用于抗風(fēng)濕和神經(jīng)痛等治療。青藤堿對(duì)胃癌、卵巢癌等多種腫瘤具有抑制作用。本研究結(jié)果發(fā)現(xiàn)青藤堿能顯著抑制SiHa細(xì)胞增殖，顯著降低SiHa細(xì)胞中的Ki67陽性細(xì)胞數(shù)。Ki67與腫瘤分期、分化程度、淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移以及復(fù)發(fā)和預(yù)后關(guān)系密切。并且隨著宮頸組織病變程度的增加，Ki67表達(dá)亦增強(qiáng)。因此青藤堿抗腫瘤作用可能通過抑制腫瘤細(xì)胞的增殖，誘導(dǎo)細(xì)胞凋亡，促進(jìn)細(xì)胞周期阻滯等發(fā)揮作用，另外還具有化療增敏作用。

同時(shí)已有研究發(fā)現(xiàn)，青藤堿具有抑制SiHa細(xì)胞侵襲的能力。Jiang等研究發(fā)現(xiàn)，青藤堿對(duì)肺癌具有抑制侵襲的作用。王高峰等的研究結(jié)果顯示青藤堿可抑制肝癌細(xì)胞的侵襲和轉(zhuǎn)移。青藤堿可以抑制乳腺癌細(xì)胞的侵襲和遷移，抑制上皮間質(zhì)轉(zhuǎn)化（epithelialmesenchymal transition，EMT）。MMP-2和MMP-9與EMT密切相關(guān)，在腫瘤侵襲中起關(guān)鍵作用。本研究發(fā)現(xiàn)，青藤堿可降低SiHa細(xì)胞中MMP-2和MMP-9的表達(dá)，進(jìn)一步證實(shí)青藤堿可能通過降低MMP-2和MMP-9表達(dá)水平從而抑制HPV陽性的宮頸癌SiHa細(xì)胞的侵襲能力。

綜上所述，青藤堿能夠抑制HPV陽性的宮頸癌SiHa細(xì)胞的增殖和侵襲能力，進(jìn)而發(fā)揮抗腫瘤作用。