甲基丙烯酸環氧丙酯誘導16HBE細胞惡性轉化相關m 6A修飾異常m RNA的分析

王 苗，王全凱，李昕葦，馬順鵬，烏瀚寶櫟爾，許建寧，

（1．中國疾病預防控制中心職業衛生與中毒控制所，北京 100050；2．中國疾病預防控制中心化學污染與健康安全重點實驗室，北京 100050）

甲基丙烯酸環氧丙酯（glycidyl methacrylate，GMA）是一種聚合反應用單體，其反應產物可作為牙科和骨科中使用的密封劑和黏合劑，也作為加工過程的副產品或包裝成分存在于食品中。GMA慢性吸入染毒，可觀察到大鼠、小鼠發生鼻腔鱗狀細胞癌、支氣管肺泡癌、子宮內膜間質肉瘤等多種類型腫瘤。2019年國際癌癥研究中心（International Agency for Research on Cancer，IARC）將GMA歸類為“對人類很可能致癌物”（2A類）。化學致癌物的致癌過程，涉及基因突變和表觀遺傳改變及其相互作用。研究表明，GMA具有致突變性，可引起人和哺乳動物細胞發生基因突變、染色體畸變等；但其致癌機制中表觀遺傳學部分有關RNA修飾的內容尚未見研究報道。

N-甲 基 腺 嘌 呤（N-methyladenosine，mA），即RNA中腺苷酸（A）第6位N原子上發生的甲基化，是真核生物mRNA中最豐富的表觀轉錄組學修飾。mA修飾受到甲基轉移酶、去甲基化酶動態可逆的調控，并且通過與識別蛋白的結合影響mRNA的加工和代謝過程，調控基因表達。研究表明mA RNA甲基化在腫瘤的形成和發展中扮演著重要的角色。本研究利用高通量人類表觀轉錄組芯片結合生物信息學方法，對GMA誘導的惡性轉化人支氣管上皮細胞（16HBE）的mRNA mA修飾水平和mRNA表達水平進行分析，篩選出mA修飾的mRNA并進行功能解釋，為從表觀遺傳學角度進一步研究GMA的致癌機制奠定基礎。

1 材料與方法

1.1 試劑與儀器

甲基丙烯酸環氧丙酯（純度≥98.5%）、二甲基亞砜（dimethyl sulfoxide，DMSO）均購于美國Sigma公司；MEM培養基（minimum essential medium，MEM）和胎牛血清由美國Gibco公司生產；青鏈霉素混合液購于北京索萊寶科技有限公司；TRIzol試劑購于上海碧云天生物技術有限公司；RNA Flash Labling Kit和RNA標記試劑盒由美國Arraystar公司生產；RNA逆轉錄試劑盒和DynabeadsM-280綿羊抗兔IgG抗體由美國Invitrogen公司生產；親和純化抗mA兔多克隆抗體由德國Synaptic Systems公司生產；RNase抑制劑由美國Enzymatics公司生產；RNA提取試劑盒由QIAGEN公司生產。

CO恒溫培養箱購于美國Thermo Fisher公司；臺式高速低溫離心機購于美國Beckman公司；倒置顯微鏡購于日本Olympus公司；ND-1000分光光度計購于美國NanoDrop公司；Arraystar Human mRNA &lncRNA Epitranscriptomic Arrays芯片技術服務和引物設計的技術支持由上海康成生物公司提供。

1.2 高通量人類表觀轉錄組芯片檢測

細胞培養與GMA誘導16HBE細胞惡性轉化的方法參照楊敏等的報道。本課題組既往研究已證實，以8μg/mL濃度GMA（DMSO為對照組）重復染毒16HBE細胞后，傳代至第30代的細胞具備惡性轉化細胞的生物學特性。采用TRIzol提取并收集細胞總RNA。使用Nanodrop ND-1000對每個樣本的總RNA進行定量，使用抗N-甲基腺苷（mA）抗體免疫沉淀，mA修飾的RNA從免疫沉淀磁珠中洗脫，稱為“IP”，未修飾的RNA從上清液中回收作為“Sup”。將“IP”和“Sup”RNA擴增為cRNA，并分別使用Arraystar Super RNA標記試劑盒進行Cy5和Cy3標記。將標記的cRNA混合，在Agilent雜交箱中于65℃下與芯片雜交17 h。洗滌芯片后，用Agilent Scanner G2505C在雙色通道中掃描獲得陣列圖像。

1.3 m6A修飾水平異常mRNA和表達水平異常mRNA的篩選

使用Agilent特征提取軟件（v11.0.1.1）對采集到的陣列圖像進行分析。IP（免疫沉淀，Cy5標記）和Sup（上清液，Cy3標記）的原始信號值進行數據標準化后，經過篩選高質量探針（某探針在6個樣品中至少有1個被標記為Present或Marginal）進行進一步分析。mA甲基化水平根據轉錄物中修飾RNA的百分比進行計算；在探針標記篩選之前，使用limma軟件包的分位數標準化方法對陣列間RNA表達水平進行標準化，RNA表達水平以轉錄本中修飾RNA和未修飾RNA的總量計算。

以變化倍數（fold change，FC）的絕對值≥2且

P

＜0.05作為閾值，篩選兩組樣品間mA修飾水平差異的mRNA和表達水平差異的mRNA。采用分級聚類的方法對兩組樣本間mA修飾水平差異的mRNA進行展示，將篩選出的表達水平差異mRNA以散點圖的形式進行可視化。

1.4 mRNA m6A修飾水平與mRNA表達水平的聯合分析

經上述步驟可得GMA誘導16HBE細胞惡性轉化相關的mRNA mA修飾水平和mRNA表達水平，使用Visual Studio Code軟件進行數據處理，將這兩個表達譜中的mRNA互相取交集，得到mA修飾的mRNA，結果以四象限圖表示。

1.5 m6A修飾mRNA的GO富集分析和KEGG通路分析

以人類基因組為背景對照，利用在線分析工具Omicshare（https://www.omicshare.com/tools/）進一步對上述mA修飾mRNA進行功能解釋，即GO富集分析和KEGG通路分析。GO分析使用0.05的閾值識別顯著豐富的GO術語，通路分析利用KEGG數據庫的超幾何檢驗進行富集分析，閾值為0.05。

2 結果

2.1 GMA誘導16HBE細胞惡性轉化過程中m6A修飾水平異常的mRNA

利用NanoDrop ND1000分光光度計檢測GMA組和DMSO組16HBE第30代細胞提取的RNA，確證所提取樣本RNA質量達到要求，如表1所示。采用高通量人類表觀轉錄組芯片檢測得到mRNA mA甲基化修飾譜，設置閾值為|FC|≥2且

P

＜0.05，篩選獲得GMA組和DMSO對照組間mA修飾水平差異的mRNA，結果以熱圖形式顯示（圖1）。與DMSO組比較，GMA組細胞中mA修飾水平差異的mRNA共有454個，其中高甲基化水平的mRNA 334個、低甲基化水平的mRNA 120個。

表1 GMA組和DMSO組細胞RNA提取質量檢測結果

圖1 GMA誘導16HBE第30代細胞惡性轉化過程中m6A修飾水平異常的mRNA

2.2 GMA誘導16HBE細胞惡性轉化過程中表達水平異常的mRNA

采用高通量人類表觀轉錄組芯片檢測結果，以轉錄本中修飾RNA和未修飾RNA的總量計算mRNA的表達水平，共有3 8647個mRNA。設置閾值為FC≥2且

P

＜0.05，篩選得到GMA組和DMSO對照組間差異表達的mRNA，結果以散點圖形式顯示（圖2）。與DMSO對照組比較，GMA組細胞中差異表達的mRNA共有434個，其中高表達水平mRNA為236個，低表達水平mRNA為198個。

圖2 GMA誘導16HBE細胞惡性轉化過程中表達水平異常的mRNA

2.3 惡性轉化的16HBE細胞中m6A修飾mRNA的GO富集分析和KEGG通路分析

GMA誘導16HBE細胞惡性轉化過程中mRNA mA修飾水平與其表達水平進行聯合分析，結果如圖3所示，mA修飾的mRNA共有45個。GO富集分析顯示，mA修飾mRNA主要富集于SNAP受體活性、SNARE結合、SNARE復合體等，具體見表2；KEGG通路分析顯示，以上基因主要富集于囊泡運輸中的SNARE相互作用、非同源末端連接、苯丙氨酸代謝通路（表3）。

表2 m6A修飾mRNA的GO數據庫富集分析結果（前10項）

表3 m6A修飾mRNA的KEGG通路數據庫富集分析結果

圖3 mRNA m6A修飾水平與其表達水平的聯合分析

3 討論

表觀遺傳是在不改變DNA基本序列的前提下通過調控基因組與環境之間的相互作用而調控基因表達的可遺傳或可繼承機制的統稱，表觀遺傳異常被認為是最重要的致癌機制之一，主要包括DNA甲基化、組蛋白修飾、染色質重塑、RNA修飾等。所有RNA修飾中，mA修飾是真核生物RNA中最常見也是分布最廣泛的表觀轉錄修飾。mA修飾由RNA甲基轉移酶（如METTL3和METTL14等）催化形成，由去甲基酶（如FTO和ALKBH5等）去除，并經mA結合蛋白（如YTHDF1和IGF2BP1等）識別來發揮功能。對真核生物中mRNA mA修飾的研究發現，mA修飾與mRNA的剪接、降解、翻譯及環狀RNA翻譯等生物學過程密切相關。研究發現，METTL3在膠質母細胞瘤干細胞（GSCs）中表達上調，通過增加干性基因

SOX2

mRNA的穩定性實現GSCs干性維持和放療抵抗。METTL14可能通過促進抑癌因子pri-miR-126和DGCR8的結合，抑制肝細胞癌細胞轉移。因此，對mRNA mA修飾的研究將有助于揭示GMA誘導16HBE細胞惡性轉化的表觀遺傳機制。本研究利用高通量人類表觀轉錄組芯片對GMA誘導的惡性轉化細胞及同代齡對照組細胞進行檢測和篩選，發現兩組細胞間mA修飾水平差異的mRNA共有454個，表達水平差異mRNA共有434個，進一步對mRNA甲基化水平與其表達水平聯合分析，獲得mA修飾的mRNA，提示GMA誘導16HBE細胞惡性轉化過程中mRNA mA修飾可能發揮重要作用。

通過GO富集分析和KEGG通路分析，發現mA修飾mRNA富集于SNAP受體活性、SNARE結合、SNARE復合體等相關的基因功能，以及囊泡運輸中的SNARE相互作用、非同源末端連接、苯丙氨酸代謝等通路中。SNARE蛋白介導分泌囊泡與質膜的錨定、融合，是真核細胞中調節膜融合的關鍵因子，參與多種細胞功能。Meng等發現SNARE蛋白參與腫瘤的發生發展進程。SNARE蛋白syntaxin4（STX4）通過與Munc18c蛋白相互作用促進腫瘤細胞侵襲偽足形成和細胞外基質侵襲。He等發現STX4在腎透明細胞癌組織中高表達。在畸胎瘤中發現，細胞外STX4激活F9細胞分化程序，從而影響細胞黏附特性。SNARE相關通路是參與腫瘤發生發展過程的重要信號通路，本研究結果提示其可能通過mA修飾參與GMA誘導16HBE細胞惡性轉化過程。通過各種DNA修復機制對細胞遺傳損傷及維持基因組穩定性作出響應，在腫瘤的發生發展過程中至關重要。通路分析富集到的另一通路非同源末端連接（non-homologous end joining，NHEJ），是指在不依賴DNA同源性的情況下，在一些修復元件的參與下將斷裂兩端的DNA直接連接的修復過程，是真核生物的主要修復方式。其中，X射線修復交叉互補基因4（X-ray repair cross complementing protein 4，XRCC4）在NHEJ通路中發揮著重要作用，是維持基因組穩定性的重要基因。研究表明，XRCC4的遺傳多態性與乳腺癌、食管癌、宮頸癌等多種癌癥易感性相關。基于表觀轉錄組芯片結合生物信息學方法分析得到與GMA誘導16HBE細胞惡性轉化關系密切的基因功能信息，尚需進一步研究驗證，但本研究結果的部分內容與已發表文獻相符，提示本研究獲得的通路及基因功能信息具有研究價值。

綜上所述，本研究使用高通量芯片檢測GMA誘導16HBE惡性轉化細胞，得到mA修飾的mRNA，結合GO富集分析和KEGG通路分析，推測這些mRNA可能通過mA修飾經囊泡運輸中的SNARE相互作用、非同源末端連接等通路在GMA誘導16HBE細胞惡性轉化過程中發揮重要作用。