細胞程序性壞死在急性肺損傷中作用的研究進展

王亞麗（綜述） 朱 蕾（審校）

（復旦大學附屬中山醫院呼吸科 上海 200032）

急性肺損傷（acute lung injury，ALI）是一類由多種因素誘發的高發病率、高死亡率的臨床疾病，除了創傷、病原微生物等對肺泡結構的直接破壞，炎癥反應失調也是ALI的重要原因，過度炎癥反應最終導致肺泡毛細血管膜彌漫性損傷和高通透性肺水腫。眾多內源性修復機制受到抑制，肺泡液清除受損，導致ALI不斷進展和急性呼吸窘迫綜合征（acute respiratory distress syndrome，ARDS）的 發生。目前，對于ALI/ARDS缺乏能夠早期高效識別高危患者的方法及特效治療手段，因此，對于ALI/ARDS的病理生理機制需要更全面深入的研究以提高臨床診療效果。程序性壞死也稱為壞死性凋亡，是一種調節性細胞死亡方式，依賴專門的分子系統，包括死亡受體（death receptor，DR）、受體相互作用蛋白激酶1（receptor-interacting protein kinase 1，RIPK 1）、RIPK 3及混合譜系激酶結構域樣蛋白（mixed-lineage kinase domain-like protein，MLKL）等。程序性壞死通常由病原體感染、缺血、缺氧等誘發，可導致肺泡上皮細胞、血管內皮細胞、巨噬細胞等多種細胞死亡并釋放炎癥介質，影響炎癥啟動、放大和慢性化等各個階段，在ALI/ARDS中發揮重要作用［1-2］，對程序性壞死的研究綜述有助于進一步理解ALI/ARDS的發病機制，有望為臨床篩選高危患者及治療重癥者提供理論依據。

程序性壞死的機制程序性壞死由腫瘤壞死因 子 受 體1（tumor necrosis factor receptor 1，TNFR1）、Toll樣受體4（Toll-like receptor 4，TLR4）和Z-DNA結 合 蛋 白1（Z-DNA binding protein 1，ZBP1）等觸發。各種類型的作用機制相似，本文以TNFR1為例介紹信號轉導過程。TNFR1與其配體TNF-α結合后，其胞內死亡折疊基序暴露，募集RIPK 1等下游分子，形成由TNFR1相關死亡結構域 蛋 白（TNFR1-associated death domain protein，TRADD）、RIPK1和線性泛素鏈組裝復合物（linear ubiquitin chain assembly complex，LUBAC）等組成的復合體，并進一步形成由RIPK1、RIPK3和MLKL組成的壞死小體。RIPK3由RIPK1激活，二者通過RIP同型基序相互作用催化一系列復雜的磷酸化反應，其中RIPK3催化MLKL磷酸化形成MLKL多聚體（三聚體或四聚體）。MLKL為程序性壞死的執行者，其多聚體通過與磷脂酰肌醇磷酸酯結合，導致細胞膜破裂，通透性增加，離子內流，細胞內滲透壓升高，進而發生細胞死亡，細胞內容物釋放，引發免疫和炎癥反應［3-4］。

RIPK1/RIPK3/MLKL是程序性壞死經典信號轉導途徑。RIPK 1、RIPK 3參與細胞凋亡，RIPK3還可在MLKL不參與的情況下調節促炎因子的基因轉錄、激活炎性小體［5］。程序性壞死與其他程序性死亡可能存在交互作用，一般情況下當細胞凋亡途徑受到抑制，細胞更容易進入程序性壞死途徑［6］。RIPK 1抑制劑如Nec-1（necrostatin-1）、MLKL抑制劑如NSA（necrosulfonamide）或RIPK 3基因敲除皆可阻斷程序性壞死，減輕炎癥反應和機體損傷。

ALI/ARDS的誘因ALI/ARDS的誘發因素包括嚴重感染、輸血、肺移植、機械通氣、脂肪栓塞等。肺炎相關ALI/ARDS最常見，金黃色葡萄球菌毒素如α-溶血素（Hla）、革蘭氏陰性桿菌外膜的重要免疫原性成分脂多糖（lipopolysaccharide，LPS）等能激活細胞程序性壞死，加劇肺損傷。膿毒癥情況下全身炎癥反應易誘發肺損傷。紅細胞輸注后釋放的成分通過誘導程序性壞死及釋放危險信號，增加肺部炎癥的易感性［7］。肺移植時供體肺缺血、缺氧或缺血后再灌注引起肺血管內皮或肺泡上皮細胞損傷；其他器官移植主要通過相關的缺血再灌注損傷釋放的炎癥介質激活程序性壞死［8］。程序性壞死通過抑制脂肪酸氧化參與呼吸機相關肺損傷（ventilatorinduced lung injury，VILI）［9］。脂肪栓塞會造成肺血管內皮、肺泡上皮細胞程序性壞死而誘發ALI/ARDS［10］。高氧暴露可能主要通過氧化應激啟動細胞的程序性壞死，進而誘發ALI/ARDS［11］。

ALI/ARDS的細胞改變ALI/ARDS發病過程中細胞會出現多種類型死亡，程序性壞死是其中之一，所占的比例主要取決于相關受體的表達情況及細胞內環境。肺泡上皮細胞、血管內皮細胞的程序性壞死直接或間接導致肺泡上皮-內皮屏障受損而發生肺水腫，并且促進大量炎癥介質釋放誘導炎癥反應。巨噬細胞，尤其是肺泡巨噬細胞，通過免疫應答及調節促炎介質和抑炎介質的平衡在ALI發生、轉歸中發揮重要作用。肺泡巨噬細胞的程序性壞死會打破該平衡而加劇炎癥反應。

肺泡上皮細胞 肺泡彌漫性損傷是ALI/ARDS基本病理改變，肺泡上皮細胞死亡是關鍵。通過對LPS誘導的肺損傷動物模型中各種細胞死亡標記物的比較，發現程序性壞死是肺泡上皮細胞主要死亡形式之一［12］。肺泡上皮細胞中RIPK1、RIPK3及MLKL均高表達。在金黃色葡萄球菌誘導的肺損傷動物模型中發現，炎癥早期出現Ⅱ型肺泡上皮細胞程序性壞死［13］。TNF-α和ZBP1均可觸發肺泡上皮細胞程序性壞死［14-16］。LPS可能通過中性粒細胞誘發肺泡上皮細胞程序性壞死［12］。體外實驗顯示，LPS刺激肺泡上皮細胞并未造成細胞死亡，而LPS+中性粒細胞處理肺泡上皮細胞后出現細胞死亡，可檢測到程序性壞死。腎移植引發的肺損傷與骨橋蛋白相關［17］。發生程序性壞死的上皮細胞產生和分泌的骨橋蛋白增加，內質網應激增加。骨橋蛋白是一種促炎因子，可以促進B淋巴細胞增值及產生免疫球蛋白，因此上皮細胞程序性壞死間接促進炎癥反應。

血管內皮細胞 向小鼠氣管內滴注高濃度LPS建立ALI模型，通過投射電鏡觀察到肺血管內皮細胞線粒體腫脹，核染色質未呈現顯著形態學改變。血管內皮細胞中TRADD、RIPK1、RIPK3、MLKL等表達顯著增加。RIPK3高表達使血管內皮鈣黏蛋白、玻黏蛋白、閉鎖連接蛋白-1等表達增加，RIPK3高表達與血管內皮鈣黏蛋白分解及肌動蛋白細胞骨架重塑緊密相關，程序性壞死導致血管內皮屏障的完整性受損、通透性增加［18］。RIPK3高表達還與凝血、內皮細胞遷移和分化、血管生成等相關，熱休克蛋白90（heat shock protein 90，HSP90）能夠正向調控血管內皮細胞程序性壞死。紅細胞刺激內皮細胞上清液后，RIPK3、高遷移率族蛋白B1（high mobility group box 1 protein，HMGB1）濃度顯著升高，RIPK1和RIPK3相互作用增加。Nec-1預處理后，上述變化明顯減弱，提示紅細胞輸注誘發的肺血管內皮細胞發生程序性壞死可能與HMGB1有關［7］。

肺泡巨噬細胞 LPS通過激活ZBP1介導肺泡巨噬細胞程序性壞死，放大炎癥信號誘導肺損傷［19-20］。高濃度LPS導致肺泡巨噬細胞數量顯著降低。在肺泡巨噬細胞中敲除ZBP1可以減輕肺損傷，肺泡灌洗液、血漿及肺泡巨噬細胞培養液中IL-1β、IL-6和TNF-α濃度降低，肺泡巨噬細胞中RIPK1、RIPK3和MLKL表達顯著下降，mtDNA/TLR4/NF-κB信號通路下調，線粒體DNA激活的NF-κB通路可使促炎因子、促炎細胞等高表達而加劇炎癥反應。Hla也會誘導肺泡巨噬細胞發生程序性壞死，加劇肺組織炎癥反應［21］。胰島素樣生長因子1（insulin-like growth factor 1，IGF-1）、c-Jun氨基端激酶（c-Jun N-terminal kinases，JNK）能夠正向調控肺泡巨噬細胞的程序性壞死而加劇肺損傷［22-23］。

ALI/ARDS的肺組織改變ALI小鼠出現肺結構破壞和肺水腫、肺活量降低、肺順應性降低。各類病因所致ALI肺組織中均發現表達RIPK 1和RIPK 3的細胞數量急劇增加，RIPK1、RIPK3、磷酸化RIPK 3、MLKL和磷酸化MLKL濃度顯著升高，RIPK 1和RIPK 3的相互作用增強。Nec-1、NSA、RIPK3-/-等干預措施下調RIPK1、RIPK3、MLKL信號分子的表達，肺部炎癥和損傷明顯減輕［10，16，21，24-27］。在H7N9流感病毒所致ARDS患者中，死亡患者肺組織RIPK1、RIPK3、磷酸化RIPK3、MLKL和磷酸化MLKL表達顯著升高，提示H7N9觸發了肺組織的程序性壞死［28］。

ALI/ARDS的肺泡灌洗液、血漿改變ALI動物模型的肺泡灌洗液中細胞總數增加、中性粒細胞數量增加，巨噬細胞數量減少，總蛋白質濃度增加，肺泡上皮細胞損傷標志物濃度增加，IL-1α、IL-1β、IL-6等炎癥相關信號分子濃度增加，MLKL濃度增加，值得注意的是ARDS患者肺泡灌洗液中的外泌體中也發現RIPK3濃度增加［29］。經過Nec-1、NSA、RIPK 3-/-等干預措施后，上述變化明顯減弱［10，16，21，24-27］。

一項隊列研究顯示，膿毒癥患者血漿RIPK3從出現到48 h后的變化量與ARDS的發生獨立相關［30］。在發病前6天發生ARDS的患者血漿RIPK3濃度增量顯著大于未出現ARDS的患者；血漿RIPK3的變化量也與30天死亡率正相關。在重癥膿毒癥患者中，血漿RIPK3濃度與RBC輸注相關［7］。輸血前，未輸血組和輸血組患者血漿RIPK3濃度無差異；輸血第2天，輸血組患者血漿RIPK 3濃度升高。其可能機制是輸注的紅細胞誘導人內皮細胞程序性壞死并釋放HMGB1，HMGB1是一種重要的炎癥介質，在膿毒癥炎癥反應中發揮重要作用。對LPS誘導的膿毒癥動物研究顯示趨化因子受體CXCR1/2可能正向調控程序性壞死，其受體拮抗劑可通過抑制程序性壞死而減輕肺損傷［31］。

Siempos等［9］的研究顯示RIPK3可能通過非依賴RIPK1、MLKL途徑抑制脂肪酸氧化介導VILI。與未使用機械通氣（mechanical ventilation，MV）的患者相比，接受MV的患者血漿游離肉堿（C0）與棕櫚酰肉堿（C16）、油基肉堿（C18）二者和的比值［C0/（C16+C18）］及RIPK3濃度更高，血漿RIPK3與C0/（C16+C18）正 相 關 ，兩 組 血 漿RIPK 1及MLKL濃度未見差異。使用MV的患者中，與非ARDS組相比，ARDS組血漿RIPK 3及C0/（C16+C18）顯著升高。C0/（C16+C18）升高反映肉毒堿棕櫚酰轉移酶（carnitine palmitoyl transferase，CPT 1）缺乏。CPT 1是一種脂肪酸β-氧化限速酶，CPT 1抑制劑可導致VILI惡化。VILI的小鼠肺組織長鏈脂肪酸（如棕櫚酸和亞油酸）濃度升高、肺泡灌洗液游離脂肪酸濃度升高；RIPK 3-/-小鼠的上述變化明顯改善，但Nec-1干預、RIPK1+/-及MLKL-/-未出現類似結果。因此，程序性壞死經典信號途徑RIPK1/RIPK3/MLKL可能未參與VILI病理過程，但RIPK3仍發揮重要作用，這提示RIPK3可能在RIPK 1、MLKL不參與的情況下介導某種炎癥信號通路，此信號通路通過抑制脂肪酸氧化，進而影響機體能量代謝使得肺損傷惡化。

結語程序性壞死導致肺泡上皮細胞、血管內皮細胞、肺泡巨噬細胞等多種細胞損傷，參與各種因素誘發的ALI/ARDS，信號轉導途徑的核心為RIPK1/RIPK3/MLKL，不同誘因下的程序性壞死調控機制略有差異，ALI/ARDS患者血漿RIPK3與疾病嚴重程度正相關，程序性壞死阻斷劑可發揮保護效應。目前大多數研究關注ALI/ARDS的早期階段，少有研究探索程序性壞死對中后期階段的影響，如肺泡毛細血管屏障修復、纖維化及預后等。程序性壞死的詳細分子機制，如程序性壞死與其他細胞活動的交互作用、經典分子通路的上下游調控機制等，也有待深入研究。

作者貢獻聲明王亞麗 文獻調研，論文構思和撰寫。朱蕾 論文校審和修訂。

利益沖突聲明所有作者均聲明不存在利益沖突。