椰子致死性黃化病綜合防控技術規程

于少帥 朱輝 余鳳玉 宋薇薇

(中國熱帶農業科學院椰子研究所/海南省院士團隊創新中心 海南文昌 571339)

植原體是一類寄生于植物韌皮部、通過刺吸式口器昆蟲傳播的原核病原菌［1-3］。由植原體引起的植物病害尚無有效的治療藥劑，是植物的毀滅性病害，因此該類病害以防為主［1-3］。由植原體引起的椰子致死性黃化病是椰子產業的一種毀滅性病害，該病害傳播快、致病性高、危害十分嚴重［4］。椰子致死性黃化病地理分布較為廣泛，在美洲、非洲和東南亞等地區均有分布［4］。已有研究表明：引起椰子致死性黃化病的植原體種類較為豐富，包括16SrI（-B）、16SrIV（-A、-B、-C、-E、-F）、16SrXI（-A、-B）、16SrXIV、16SrXXII（-A、-B）、16SrXXXII（-B）等多個組或亞組［4-6］。

椰子是中國海南主要的特色作物，具有重要的經濟、綠化和生態價值［7］。截止目前，椰子致死性植原體在國內尚未見報道，但海南是中國椰子主產區，椰子致死性植原體在中國的適應性分析和入侵中國的風險分析表明，中國為椰子植原體的適生區，華南沿海及海南大部分地區為中、高風險區［8-9］。結合前期研究基礎和相關文獻，總結、制定了由植原體引起的椰子致死性黃化病的綜合防控技術規程，以椰子致死性植原體檢測鑒定為基礎，以防為主，在此基礎上對椰子致死性黃化病進行綜合防控，以期有效防控此類病害。

1 適用范圍

本技術規程規定了椰子致死性黃化病防控過程中的術語和定義、分子檢測技術、防控技術和注意事項等要求。

2 術語和定義

下列術語和定義適用于本規程。

2.1 植原體（Phytoplasma）

植原體是一類寄生于植物韌皮部、無細胞壁、尚不能人工分離培養的一類重要的原核致病菌［1-3］。

2.2 椰子致死性黃化病（coconut lethal yellowing diseases）

由植原體引起的椰子致死性病害，典型癥狀表現為成熟或未發育完全的果實脫落，葉片從葉尖開始向莖干的方向變黃，老葉先表現癥狀，最后是嫩葉表現癥狀，葉片最后從莖干上脫落［4］。目前中國尚未見該病報道，但分析表明中國為該病病原的適生區，極具被入侵風險［8-9］。

2.3 PCR擴增

聚合酶鏈式反應 （polymerase chain reaction， PCR） 是一種在生物體外放大擴增特定的DNA片段的分子生物學技術［10］。

2.4 巢式PCR

使用2 對PCR 引物對特定DNA 片段進行擴增。第一對PCR 引物擴增片段和普通PCR 相似，第二對PCR 引物結合在第一對PCR 引物擴增產物內部，第二次PCR 擴增片段短于第一次PCR 擴增片段，擴增結果更特異［10］。

2.5 綜合防控

根據檢測分析結果，采用物理清除、化學噴殺、水肥調節等綜合技術措施對病害進行預防與控制。

3 巢式PCR檢測

3.1 總DNA提取

樣品葉片取樣量為0.1 g，利用CTAB 法提取疑似發病椰子葉片的總DNA［11］，樣品總DNA 提取方法參考天根植物基因組DNA 提取試劑盒說明書。

3.2 PCR擴增

引起椰子致死性黃化病的病原植原體采用植原 體 通 用 引 物 R16mF2/R16mR1［12］和 R16F2n/R16R2［13］進行擴增檢測。將引物 R16mF2/R16mR1 擴增的PCR產物稀釋50倍后用作巢式PCR模板，直接PCR 擴增引物R16mF2/R16mR1 擴增的植原體目的條帶長約1 400 bp，巢式PCR 擴增引物R16F2n/R16R2擴增的植原體目的條帶長約1 200 bp，PCR 擴增引物由生工生物工程（上海）股份有限公司合成。

3.3 PCR反應體系

PCR 反 應體系為 25 μL，包括 12.5 μL 2 ×PCR Master Mix （包含0.05 U/μLTaqDNA 聚合酶，4 mmol/L MgCl2和0.4 mmol/L dNTPs），上游引物和下游引物 （10 μmol/L） 各1.0 μL，1.0 μL DNA 模板，用ddH2O補至25μL。

3.4 PCR反應條件

反 應 條 件 ： 94.0℃ 5 min； 94.0℃ 30 s，53.0℃ 40 s，72.0℃ 90 s （第一輪 PCR） 或 80 s（第二輪PCR），共35個循環；72.0℃10 min。

3.5 擴增產物檢測

PCR 擴增產物用SYBR Green I 染色，經1.0 %（w/V）瓊脂糖凝膠、凝膠成像系統檢測，將PCR擴增產物送測序公司進行測序分析。

3.6 序列編輯與鑒定

將獲得的核苷酸序列采用DNA MAN 6.0 軟件（Lynnon Corporation， Vaudreuil-Dorion，Quebec，Canada）進行編輯及多重比對分析。在NCBI 數據庫進行 BLAST 分析 （https：//blast.ncbi.nlm.nih.gov/Blast.cgi），明確所得核苷酸序列與GenBank數據庫中已報道的椰子致死性黃化植原體相關核苷酸序列的同源性是否較高。利用MEGA 7.0 軟件的鄰接法（neighbor-joining， NJ）構建系統發育樹［14］。將自展值（bootstrap value）設為1 000，用以評估軟件生成的系統進化樹的穩定性和支持率［15］，明確所得核苷酸序列與已報道的椰子致死性黃化植原體相關核苷酸序列的系統發育關系是否較近。根據序列同源性的高低與系統發育關系的遠近，判斷并鑒定椰子致死性黃化植原體及其種類等信息。

4 防控技術

4.1 把好種苗檢測關

目前中國尚未見椰子感染致死性植原體的報道，椰子種苗的出入境檢測十分重要。植原體最易通過苗木等材料傳播，因此，應對外來的椰子苗木進行嚴格檢疫，以防止椰子致死性植原體的入侵。

4.2 產地檢疫

在椰子產地，應通過植原體通用型引物PCR擴增，加強對產地椰子果及其種苗的檢驗檢疫，保證從椰子產地輸出的果實、種苗等產品健康無毒，從源頭上切斷椰子致死性植原體的傳播。

4.3 選育抗耐病資源

植原體病害目前尚無有效治療藥劑，因此，抗耐病種質資源的選育、應用是防控此類病害的根本措施。為防控椰子致死性黃化病，應通過對現有資源進行抗逆性評價鑒定、品種雜交、分子育種等選育椰子抗耐植原體資源，并在全球椰子種植區進行種植推廣。

4.4 清除病源

加強田間管理，及時清理、燒毀椰子林中表現致死性黃化病癥狀的椰子樹和苦楝、長春花、辣椒、細圓藤、山黃麻、蛇婆子等相關植原體寄主植物［16-20］，清除椰子林中的植原體傳染源。

4.5 切斷傳播途徑

根據不同地區不同椰子林中刺吸式口器昆蟲的種類及其種群動態變化，確定噴灑殺蟲劑的時間及周期，全面清除椰子園中的葉蟬類、粉虱類、蝽類等刺吸式口器昆蟲［3］，預防植原體在椰子林中的傳播。

4.6 水肥調節

在椰子種植過程中，在貧瘠的椰子種植區施用氮肥，在酸性土壤有效磷極低的情況下增施磷肥，在椰子果實發育初期增施鉀肥，根據椰子種植園地情況適當澆水，以防止干旱對椰子生長的影響［7］。通過加強水肥管理，增強樹體免疫力。

5 注意事項

5.1 擴大葉片取樣范圍

棕櫚作物染病組織中植原體含量低，且分布不均。因此，在DNA提取時，應取盡量多的葉片粉碎混勻后，再稱取0.1 g樣品進行DNA提取。此外，植原體寄生于植物韌皮部，椰子等棕櫚作物纖維組織發達，因此，在DNA提取時，應適當增加椰子樣品的粉碎時間以便使樣品充分粉碎、病原充分釋放。

5.2 防止巢式PCR污染

巢式PCR 需要進行兩輪PCR 擴增反應，在第一輪PCR 擴增反應結束后，需要對第一輪PCR 擴增產物進行稀釋，以用作第二輪PCR 擴增的反應模板。在第一輪PCR擴增產物稀釋過程中，要將擴增產物放4℃冰箱靜置1 h 以上，在超凈工作臺上進行稀釋，以防止產生污染，否則將影響第二輪PCR擴增反應的效果。

5.3 設置實驗對照與重復

為保證PCR 擴增結果與測序結果的準確客觀，在進行椰子致死性黃化病或疑似病害樣品植原體檢測過程中，應設置陽性對照和陰性對照。前期已檢測到植原體的樣品可作為陽性對照，去離子水和健康無植原體的樣品可作為陰性對照，相關的陽性對照和陰性對照各設置1 個；并通過重復1～2次實驗對PCR擴增結果與測序結果進行驗證。