對GB/T 14233.2-2005 修訂的建議

肖佳音，李慶忠

黑龍江省藥品檢驗研究中心，黑龍江 哈爾濱 150088

GB/T 14233.2-2005《醫用輸液、輸血、注射器具檢驗方法 第2 部分：生物試驗方法》［1］是我國現行的醫用輸液、輸血、注射器具的國家推薦標準，是我國醫用輸液、輸血、注射器具檢測的重要技術依據，為保障該類醫療器械的臨床使用安全起到了至關重要的作用。GB/T 14233.2-2005 是在GB/T 16886《醫療器械生物學評價》和《中國藥典》兩部分內容的基礎上，結合醫用輸液、輸血、注射器具的特性制定的，筆者認為基本上合理，但仍兩處需進一步完善。

1 細菌內毒素試驗

GB/T 14233.2-2005 中細菌內毒素試驗要求按《中國藥典》［2］細菌內毒素檢查法中的“凝膠法”規定進行。推薦輸液、輸血、注射器具細菌內毒素限量每件不超過20 EU，與腦脊液接觸和胸內應用醫療器械每件不超過2.15 EU。

凝膠法是通過鱟試劑與內毒素產生凝集反應的原理進行限度檢測或半定量檢測內毒素的方法，包括凝膠限度試驗和凝膠半定量實驗［3］。當檢測結果有爭議時，除另有規定外，以凝膠限度試驗結果為準［4］。凝膠法系通過鱟試劑與內毒素產生凝膠反應的原理，通過觀察有無凝膠形成作為反應的終點，是一種限度試驗。使鱟試劑產生凝集的內毒素的最低濃度即為鱟試劑的標示靈敏度。按照《中國藥典》2020 版四部細菌內毒素凝膠限度試驗檢查法規定，當試驗結果顯示陰性時，判定供試品中的細菌內毒素含量小于規定的限值；而當試驗結果顯示陽性時，判定供試品中的細菌內毒素含量大于或等于限值。也就是說，使用細菌內毒素凝膠法，當出現陽性結果時，實際上是無法區分究竟是大于限值還是等于限值的。而GB/T 14233.2-2005 判定結果中描述的“不超過”包含小于和等于兩層含義，而“等于”凝膠限度試驗無法觀察到的。筆者認為應將限值修訂為“推薦輸液、輸血、注射器具細菌內毒素限量每件應小于20 EU，與腦脊液接觸和胸內應用醫療器械每件應小于2.15 EU”。

2 細胞毒性試驗

GB/T 14233.2-2005 中細胞毒性試驗主要依據GB/T 16886.5-2003《醫療器械生物學評價 第5 部分：體外細胞毒性試驗》［5］制定的，GB/T 16886.5 已于2018 年7 月1 日執行新版本，即GB/T 16886.5-2017 替代原GB/T 16886.5-2003 版本。二者比較，在以下四方面有明顯變化。

2.1 培養基

GB/T 16886.5-2017 較上一版標準，在附錄CMTT 細胞毒性試驗中明確了培養基應使用依格爾最低限量基本培養基MEM（不含酚紅、谷氨酰胺、碳酸氫鈉）。MEM 是哺乳動物細胞的理想培養基，相對于GB/T 14233.2-2005 中推薦的RPMI1640 培養基更適用于貼壁細胞的培養，也美國典型培養物保藏中心（ATCC）推薦的用于L929 的細胞培養基。

2.2 更換培養液后的時間

GB/T 14233.2-2005 中要求在更換培養液后的72 h 觀察細胞形態并測定細胞相對增殖率。GB/T 16886.5-2017 中要求在更換培養液后的24 h 測定。胡煜雯等［6］提出換液后培養時間越長，空白對照組細胞收到抑制甚至凋亡的可能性越大，導致假陰性結果的可能性越高。

2.3 布板

GB/T 14233.2-2005 中要求空白對照組、陰性對照組、陽性對照組和供試品組，每組各設6 孔。GB/T 16886.5-2017 中明確為檢查細胞接種誤差，不使用第1 列和第12 列，將空白加到96 孔板的第2 列和第11 列。左右兩列平均值大于等于0.2 且左右兩列空白平均值與全部空白平均值相差不大于15%，試驗符合接受標準。

2.4 終結果判定

GB/T 14233.2 中，在570 nm 和630 nm 波長下測定吸光度計算相對增殖率，按0～4 級分級判定。因培養基由MEM 代替RPMI1640，相應GB/T 16886.5把參考波長改為650 nm，若供試品細胞存活率降低小于空白對照組的70%，說明該供試品具有潛在的細胞毒性。

3 討論

醫療器械作為現代人們醫療的必須手段，其安全有效性的評價是保障我國醫療事業健康發展的基礎［7］。細菌內毒素試驗和細胞毒性試驗是醫用輸液、輸血、注射器具類乃至全部醫療器械生物相容性評價的重要項目。細菌內毒素檢查法中“應小于”的概念是基于凝膠法反應原理［8］提出的，而“不超過”這一概念中的“等于”是凝膠限度試驗無法觀察到的，極易引起歧義。關于細胞毒性試驗，有研究表明［9-10］，在不同的試驗條件下應用MTT 法，對同一待檢物進行檢測會得到不同的細胞毒性結果，因此標準化MTT 試驗方法對醫療器械細胞毒性試驗評價的客觀性和科學性具有十分重要的意義。

以上是筆者對GB/T 14233.2-2005 中細菌內毒素試驗及細胞毒性試驗的幾點看法，希望能對推進標準修訂起到一定的促進作用。