微塑料聚乙烯、聚氯乙烯對大型蚤的毒性作用研究

祝慧玲 宋怡彤

摘要：本實驗以大型蚤為模式生物，探討兩種微塑料對大型蚤的生長、繁殖及營養(yǎng)狀況等毒性效應(yīng)。結(jié)果表明，5 μm粒徑的PE和PVC對大型的LC50-96h值分別為199.99 mg·L-1和48.19 mg·L-1，兩種微塑料暴露21 d后，PE和PVC顯著抑制大型蚤的脫皮數(shù)和心率以及降低大型蚤體內(nèi)蛋白質(zhì)的含量.

關(guān)鍵詞：微塑料，PE，PVC，毒性效應(yīng)

Study on the Toxicity of Polyethylene and Polyvinyl Chloride to Daphnia magna in microplastics

Zhu Huiling，Song Yitong

Department of biology and environmental engineering，Zhejiang Shuren University，Hangzhou，310015，China

Abstract：In this experiment，Daphnia magna was used as a model organism to investigate the toxic effects of two microplastics on the growth，reproduction and nutritional status of Daphnia magna.The results showed that the LC50–96 h values of PE and PVC with 5μm particle size for Daphnia magna were 199.99 mg·L-1and 48.19 ?mg·L-1，respectively.After exposure to two microplastics for 21 days，PE and PVC significantly inhibited the desquamation number and heart rate of Daphnia magna and reduced the content of protein in Daphnia magna.Keywords：microplastics，PE，PVC，toxic effects，mechanism

1.引言

微塑料（MPs）是指直徑小于5 mm的塑料碎屑和顆粒，其作為一種新興環(huán)境污染物已引起了全球研究學(xué)者和公眾的廣泛關(guān)注。目前的研究證明，微塑料廣泛存在于全球海洋、地表水、土壤、沉積物和空氣等環(huán)境介質(zhì)中，微塑料的來源、分布、毒理效應(yīng)、生態(tài)及健康風(fēng)險已成為研究熱點[1]。水環(huán)境中最常檢測到的微塑料主要包括聚乙烯（PE）、聚氯乙稀（PVC）、聚丙稀（PP）、聚苯乙烯（PS）等。其中PE是乙烯經(jīng)聚合制得的一種熱塑性樹脂，主要用于身體、面部磨砂膏等個人護(hù)理用品和食品包裝膜、水瓶等;PVC是氯乙烯單體在過氧化物、偶氮化合物等引發(fā)劑或在光、熱作用下按自由基聚合反應(yīng)機(jī)理聚合而成的聚合物，主要用于排水管、電線、電纜、插銷、汽車材料、醫(yī)療器械等。我國是PE、PVC的生產(chǎn)和消費大國，2019年的消費量分別達(dá)到3383萬噸和2027萬噸[2]。微塑料在水環(huán)境中漂浮、沉積和轉(zhuǎn)移，不可避免地與浮游生物發(fā)生接觸，了解微塑料對浮游生物的影響是評價其生態(tài)風(fēng)險的重要依據(jù)。對于水生植物而言，微塑料的存在會降低下層水體的透明度，從而抑制其光合作用;而對于水生動物，當(dāng)微塑料尺度小于動物攝食口器的大小時則可以直接進(jìn)入動物體內(nèi)，通過食物鏈在營養(yǎng)級之間轉(zhuǎn)移，危害大型水生動物和整個水生態(tài)系統(tǒng)。此外，微塑料還可能吸附環(huán)境中的其他污染物而構(gòu)成復(fù)合污染[3]。枝角類是淡水生態(tài)系統(tǒng)中物質(zhì)循環(huán)和能量流動中的重要環(huán)節(jié)，它們對毒物有很強(qiáng)的敏感性。由于大型蚤在水生態(tài)系統(tǒng)食物網(wǎng)中的優(yōu)越性地位，且生殖周期短、繁殖迅速、對水體中有害污染物敏感（在各種環(huán)境壓力下，表現(xiàn)出生殖力下降、活動抑制等行為異常）等特點，使其作為國際公認(rèn)的標(biāo)準(zhǔn)試驗生物廣泛應(yīng)用于水環(huán)境質(zhì)量評價和水生生態(tài)毒理學(xué)研究中[4]。美國環(huán)保局于1978年將大型蚤定為毒性試驗的必測項目，建立了大型蚤急性毒性測試的標(biāo)準(zhǔn)方法。1991年，我國也建立了相關(guān)標(biāo)準(zhǔn)方法[5]，塑料降解過程產(chǎn)生的一系列的脅迫因子不可避免地會對大型蚤產(chǎn)生影響，研究微塑料對大型蚤的毒性對評價微塑料的生態(tài)效應(yīng)具有重要的意義[6]。

本研究以PE和PVC為研究對象，以水環(huán)境初級消費者大型蚤為模式生物，通過探討兩種微塑料PE和PVC對大型蚤的急性毒性致死率以及21d慢性藥物暴露對大型蚤的生長、繁殖及體內(nèi)蛋白質(zhì)含量等毒性效應(yīng)，評價PE、PVC對水生態(tài)環(huán)境的影響及可能的健康風(fēng)險，為微塑料類物質(zhì)的生態(tài)危害及可能的健康風(fēng)險評價提供科學(xué)依據(jù)。

2.實驗材料與方法

2.1實驗材料

2.1.1模式生物大型蚤和其食物斜生柵藻的實驗室馴養(yǎng)

大型蚤（Daphnia magna）是購自武漢科樂多生物科技有限公司大型蚤62 D.M生物株。選用OECD M4培養(yǎng)基作為大型蚤的培養(yǎng)液，培養(yǎng)條件為pH 7.8±0.2，硬度250 mg·L-1±25 mg·L-1（以CaCO3表示），Ca/Mg摩爾比接近4：1，溶解氧濃度大于2 mg·L-1。大型蚤培養(yǎng)4代后，以出生6-24 h的同批幼蚤進(jìn)行毒性試驗。斜生柵藻購自中國科學(xué)院水生生物研究所，以水生4號（HB-IV）人工培養(yǎng)液作為斜生柵藻的培養(yǎng)基。所有使用到的玻璃器皿及培養(yǎng)液均經(jīng)過HVE-50自動高壓滅菌器121℃高溫滅菌30 min，冷卻后置于超凈工作臺內(nèi)，用紫外線照射滅菌30 min，避免藻種受到其他藻類和細(xì)菌的污染。接種方法：用1000 mL三角燒瓶移取400～600 mL新鮮的水生4號培養(yǎng)基，接入藻種使之成為淡綠色。接種完成后用八層滅菌過的無紡紗布封口防止藻液受到污染，并標(biāo)上接種日期和種類，移至智能人工氣候箱中培養(yǎng)。培養(yǎng)條件：光暗比12 h：12 h，光照強(qiáng)度2000 lux左右，培養(yǎng)溫度25℃左右，每天定期搖瓶5～6次防止藻種老化沉淀，以5-6天的頻率接種一次。經(jīng)常鏡檢觀察藻種是否單一（形狀上觀察）、有無其它雜菌。預(yù)培養(yǎng)3代，鏡檢細(xì)胞正常，進(jìn)入對數(shù)生長期時進(jìn)行試驗。

2.1.2PE和PVC測試液的配制

低密度聚乙烯（PE）和聚氯乙烯（PVC）購自上海陽勵機(jī)電科技有限公司，均為5 μm優(yōu)級純微粉。試驗所用其余試劑均為分析純，實驗用水為超純水。分散劑Tween80溶液的配置：先用移液槍取1.5μL的分散劑Tween80加入到含100mL大型蚤M4培養(yǎng)基的燒杯中，在漩渦振蕩器上震蕩30s后，超聲分散30min，即得到分散劑溶液。稱取0.04g粉末狀聚乙烯（或聚氯乙烯）顆粒于100mL分散劑溶液中，在漩渦振蕩器上震蕩1min后，超聲分散30min，得到400mg/L的聚乙烯（或聚氯乙烯）測試液。其他濃度配制方法同理。

2.2 PE和PVC對大型蚤的急性毒性

按照ISO標(biāo)準(zhǔn)試驗方法進(jìn)行聚乙烯和聚氯乙烯對大型蚤的急性毒性試驗。試驗容器為潔凈的50 mL小燒杯，盛20 mL試驗溶液，每個燒杯中放入5只剛出生6-24h的幼蚤，PE和PVC的大型蚤暴露濃度均設(shè)置為0、12.5、25、50、100、200、400 mg·L-1，水溫20～22°C，光照周期為16h光照：8h黑暗，試驗期間不喂食，每個濃度5組平行，連續(xù)暴露96 h后，分別記錄大型蚤24、48、72、96 h的死亡情況，計算兩種微塑料對大型蚤的致死率并采用SPSS17.0進(jìn)行單因素方差分析，計算PE和PVC對大型蚤半數(shù)致死濃度LC50值。

2.3 PE和PVC對大型蚤的生長繁殖等慢性毒性

根據(jù)急性毒性試驗求得的兩種微塑料對大型蚤LC50值，慢性試驗的PE濃度設(shè)置分別為0、12.5、25、50、100 mg·L-1;PVC濃度設(shè)置為0、3、6、12、24 mg·L-1，慢性毒性試驗按照OECD標(biāo)準(zhǔn)方法。每個燒杯中放1只剛出生6-24h的幼蚤，每濃度設(shè)置10個平行，染毒過程中保證蚤類的生活環(huán)境適宜和食物充足，并且每天定時觀察、記錄和分離幼蚤，每3d更換一次培養(yǎng)液，其余條件與急性毒性試驗相同。每天記錄大型蚤脫皮情況并且及時移出。試驗21 d后統(tǒng)計兩種藥物各濃度下的脫皮數(shù)，并于XD-202倒置生物顯微鏡下測定大型蚤的心率。心率的測定步驟：使用XD-202倒置生物顯微鏡對每組隨機(jī)挑選3只大型蚤進(jìn)行1min的錄像，然后使用計數(shù)器對錄像結(jié)果進(jìn)行大型蚤跳動次數(shù)的計數(shù)，每個視頻計數(shù)三次。

2.4 PE和PVC對大型蚤蛋白質(zhì)含量的影響

取暴露21 d的大型蚤，超純水沖洗干凈并吸干水分后稱重，加入3 mL0.9%的生理鹽水，在冰水浴條件下超聲破碎 15 min機(jī)械勻漿，勻漿液于高速冷凍離心機(jī)中4℃、15000 r·min-1離心10 min后，采用考馬斯亮藍(lán)法測定大型蚤蛋白質(zhì)含量。步驟：準(zhǔn)確稱取10 mg牛血清白蛋白，溶于100 mL蒸餾水中，即為100 ug·mL-1的原液。稱取100 mg 考馬斯亮藍(lán)G-250，溶于50 mL90%乙醇中，加入85%（W/V）的磷酸100 mL，最后用蒸餾水定容到250 mL。取6 支10 mL 干凈的離心管，按表1 取樣。蓋塞后混合，放置2 min 后用1 cm 光經(jīng)的比色杯在595 nm 波長下比色，記錄各管測定的光密度OD595 nm，并做標(biāo)準(zhǔn)曲線。取10 mL 離心管 ，按下表取樣。吸取提取液0.2 mL，放入離心管 中，加入5 mL 考馬斯亮藍(lán)G-250 蛋白試劑，充分混合，放置2 min 后用1 cm 光徑比色杯在595 nm 下比色，記錄光密度OD 595 nm，并通過標(biāo)準(zhǔn)曲線查得待測樣品提取液中蛋白質(zhì)的含量X（μg）。

2.5 數(shù)據(jù)處理

實驗所得數(shù)據(jù)使用origin8.0進(jìn)行處理和作圖，采用SPSS17.0進(jìn)行單因素方差分析（ANOVA），并用Duncan法進(jìn)行多組樣本間差異顯著性分析檢驗，p<0.05為差異顯著。數(shù)據(jù)結(jié)果采用means±SD的方法。

3.結(jié)果與討論

3.1 PE和PVC對大型蚤的急性毒性

圖1為PE和PVC對模式生物大型蚤24h、48h、72h、96h的急性毒性影響結(jié)果。由圖可得出，在濃度為12.5mg·L-1的PE和PVC暴露組，模式生物大型蚤均出現(xiàn)死亡，隨著時間的推移，尤其以PVC暴露下的大型蚤死亡率最為明顯，而PE暴露組大型蚤死亡率則微有波動。兩種微塑料對模式生物大型蚤的致死作用會隨著時間的推移而加大，由圖可見，微塑料PVC暴露組下的大型蚤死亡率增大較微塑料PE暴露組明顯。微塑料PE暴露組在24h急性毒性作用下，模式生物大型蚤未出現(xiàn)死亡，也說明了微塑料PE對大型蚤的急性致死作用要稍低于微塑料PVC。微塑料PE在分散劑Tween80作用下在純水中呈懸浮狀態(tài)，而微塑料PVC呈現(xiàn)乳濁液，所以隨著時間的增加模式生物大型蚤的死亡率增大，微塑料PE暴露組50mg·L-1濃度下，大型蚤的死亡率和400mg·L-1濃度暴露組相當(dāng)，原因是隨著時間的推移，微塑料PE慢慢聚集，50mg·L-1濃度下微塑料聚集度不高剛好可以被大型蚤攝取，而100mg·L-1和200mg·L-1濃度下的微塑料PE聚集度過大，導(dǎo)致大型蚤無法攝取。微塑料對大型蚤的致死原因不僅表現(xiàn)在大型蚤攝入體內(nèi)產(chǎn)生的消化道等堵塞，還會纏在大型蚤身上，使得大型蚤游動能力下降而死亡，所以在400mg·L-1濃度下，大型蚤死亡的原因可能是游動能力受到了束縛而致死。微塑料PVC在純水中呈乳濁液，隨著時間增加，會有部分沉在燒杯底部，所以其對大型蚤的致死情況也表現(xiàn)出在微塑料100mg·L-1與400mg·L-1濃度下相當(dāng)。

實驗求得PE和PVC對大型蚤的LC50-96h值分別為107.98mg·L-1和26.81 mg·L-1。李勤和方海燕等分別了考察了不同粒徑大小的PVC對大型蚤的急性毒性作用發(fā)現(xiàn)，15 μm的PVC微塑料對大型蚤LC50-96h為130.1 mg·L-1 [7];2 μm的PVC對大型蚤48 h LC50為20.5 mg·L-1 [8]，與本實驗結(jié)果相當(dāng)。

3.2 PE和PVC對大型蚤脫皮數(shù)和心率的影響

經(jīng)過21d的微塑料PE和PVC的慢性暴露，各濃度組僅有少數(shù)大型蚤死亡。微塑料PE暴露組12.5mg·L-1濃度第10天死亡1只、50mg·L-1濃度第19天死亡1只、100mg·L-1濃度第6天死亡1只;微塑料PVC暴露組6mg·L-1濃度第13天和第17天各死亡1只。脫皮數(shù)是大型蚤生長的一個指標(biāo)，大型蚤每脫一次皮代表大型蚤生長發(fā)育一回。微塑料PE和PVC兩種藥物暴露21d的慢性毒性試驗，每天觀察大型蚤的繁殖代謝情況，記錄每只母蚤在實驗期間的蛻皮數(shù)，21d后統(tǒng)計總脫皮數(shù)。微塑料PE暴露組從小到大各個濃度下21d大型蚤的脫皮總數(shù)分別為61個、61個、69個、57個;微塑料PVC暴露組從小到大各個濃度下21d大型蚤的脫皮總數(shù)分別為77個、76個、73個、71個，與對照組脫皮數(shù)84個相比均低于對照組。表明兩種藥物暴露阻礙了大型蚤的生長，對其生長發(fā)育產(chǎn)生了抑制作用。

試驗21 d后于XD-202倒置生物顯微鏡下測定大型蚤心率，由圖2大型蚤于兩種微塑料中暴露21 d后的心率變化結(jié)果可見，12.5～100 mg·L-1 PE作用下大型蚤的心率分別相當(dāng)于對照值的81.5%、79.8%、72.8%和70.1%;3～24 mg·L-1 PVC作用下的大型蚤的心率分別相當(dāng)于對照值的89.4%、80.1%、69.9%和61.8%，均顯著低于對照。說明在兩種微塑料藥物的暴露下，大型蚤的心臟功能發(fā)生了變化，會降低機(jī)體內(nèi)的物質(zhì)循環(huán)的速率，導(dǎo)致大型蚤對攝入體內(nèi)的食物的消化吸收能力降低，從而加速大型蚤的死亡。對比兩種微塑料對大型蚤心率的影響來看，微塑料PE暴露組大型蚤的心率呈現(xiàn)陡坡式下降，而微塑料PVC暴露組大型蚤的心率呈直線型下降。且兩種微塑料的最高濃度組PVC24 mg·L-1的心率比 PE100 mg·L-1的心率更低，由此可以看出，微塑料PVC暴露組對大型蚤心率的影響較微塑料PE暴露組更大。

3.3 PE和PVC對大型蚤蛋白質(zhì)含量的影響

蛋白質(zhì)是評價大型蚤營養(yǎng)狀況的指標(biāo)之一，當(dāng)大型蚤長時間暴露在微塑料中，微塑料會進(jìn)入大型蚤消化道造成消化道堵塞，導(dǎo)致大型蚤攝入體內(nèi)的食物長時間無法消化，體內(nèi)蛋白質(zhì)含量降低;再者，大型蚤把微塑料當(dāng)成食物攝入體內(nèi)造成飽腹感，而微塑料在體內(nèi)無法被大型蚤消化吸收，所以導(dǎo)致大型蚤體內(nèi)蛋白質(zhì)含量下降。

由圖3大型蚤于兩種微塑料中暴露21 d后體內(nèi)蛋白質(zhì)含量變化結(jié)果可見，微塑料PE暴露組隨著濃度的增加，模式生物大型蚤體內(nèi)的蛋白質(zhì)呈階梯型下降的趨勢。而相對于微塑料PE暴露組，微塑料PVC暴露組大型蚤體內(nèi)的蛋白質(zhì)含量隨著濃度逐漸增大下降的趨勢比較平緩，尤其是濃度0～12 mg·L-1 大型蚤體內(nèi)蛋白質(zhì)含量下降趨勢微小，而濃度為24mg·L-1 大型蚤體內(nèi)蛋白質(zhì)含量顯著下降。我們猜測，微塑料PE經(jīng)分散劑Tween80分散后在純水中呈懸浮狀，顆粒較大，大型蚤攝入體內(nèi)后產(chǎn)生的飽腹感以及造成腸道堵塞的程度大，所以隨著濃度的增加，大型蚤體內(nèi)蛋白質(zhì)含量呈明顯的下降趨勢。而微塑料PVC經(jīng)分散劑Tween80分散后是乳濁液，形態(tài)與大型蚤攝入體內(nèi)的食物斜生柵藻相似，在一定濃度范圍內(nèi)對大型蚤腸道內(nèi)的堵塞程度不明顯，大型蚤對食物的消化能力沒有受到很大程度上的限制，但當(dāng)微塑料PVC濃度達(dá)到一定程度，大型蚤腸道堵塞嚴(yán)重，影響了其對食物的消化，抑制了體內(nèi)蛋白質(zhì)的合成，所以當(dāng)濃度為24 mg·L-1 時，大型蚤體內(nèi)蛋白質(zhì)含量出現(xiàn)了急劇降低的現(xiàn)象。

4.結(jié)論與應(yīng)用前景展望

（1） 96 h的急性毒性試驗求得5 μm粒徑的PE和PVC對大型的LC50-96h值分別為107.98mg·L-1和26.81 mg·L-1，表明相同條件下PVC對大型蚤的急性毒性較PE更強(qiáng)。

（2） PE和PVC兩種微塑料暴露21 d后，較高濃度的PE和PVC對大型蚤生長和繁殖等生命活動均具有顯著影響。表現(xiàn)為大型蚤的脫皮數(shù)減少，在XD-202倒置生物顯微鏡下測得的大型蚤心率下降，說明兩種藥物對大型蚤的生長發(fā)育產(chǎn)生了抑制作用。

（3） PE和PVC兩種微塑料暴露21d后，模式生物大型蚤體內(nèi)的蛋白質(zhì)含量隨著藥物濃度的升高而呈現(xiàn)明顯下降的趨勢，表面兩種微塑料對大型蚤的營養(yǎng)狀況產(chǎn)生了危害作用。

（4）微塑料是一種新型環(huán)境污染物，成為了近年來比較熱門的研究對象，國內(nèi)對微塑料毒性的探索還在比較淺層的階段。微塑料不僅會對水環(huán)境、大氣環(huán)境、土壤環(huán)境等造成危害，而且對生物及人類的危害是不可估量的。由于微塑料毒害的潛在性和漫長性，人們?nèi)菀缀鲆曀拇嬖冢乾F(xiàn)階段對微塑料的研究以及探索解決微塑料污染的辦法是人們亟待解決的問題。對微塑料毒性的探索是一個永無止境的過程，它將會是人類探索道路上的一大挑戰(zhàn)。

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作者簡介：祝慧玲（1998-），籍貫：浙江衢州人，浙江樹人大學(xué)，大學(xué)本科，毒理學(xué)方向。