卡巴他賽細菌內(nèi)毒素檢查方法學研究

王秀艷 段春艷 王以云

摘要：目的：建立卡巴他賽細菌內(nèi)毒素檢查方法。方法：按照《中華人民共和國藥典》2020版四部通則1143細菌內(nèi)毒素凝膠檢查法的要求，采用兩個廠家的鱟試劑進行細菌內(nèi)毒素干擾試驗，并對樣品進行細菌內(nèi)毒素檢查。結(jié)果：卡巴他賽用細菌內(nèi)毒素檢查用水和無水乙醇及吐溫80溶解成6mg·ml-1的溶液，再稀釋至24倍時，對細菌內(nèi)毒素檢查無干擾。結(jié)論：可采用此法對卡巴他賽的細菌內(nèi)毒素進行檢查。

關鍵詞：卡巴他賽;細菌內(nèi)毒素;凝膠法;干擾試驗

內(nèi)毒素是革蘭陰性細菌細胞壁脂多糖，極微量（1ng/kg）的內(nèi)毒素進入人體即可引起發(fā)熱反應。大劑量的內(nèi)毒素可引起機體發(fā)生內(nèi)毒素休克、彌散性血管內(nèi)凝血、多器官衰竭等反應，甚至導致死亡。故注射劑中細菌內(nèi)毒素含量應嚴格控制，生產(chǎn)注射劑所使用的原料中內(nèi)毒素的含量也應進行控制，以保證注射劑的安全性。

卡巴他賽是一種治療前列腺癌的二線藥物，是化學半合成紫杉烷類小分子化合物。

本研究對卡巴他賽細菌內(nèi)毒素檢查的可行性進行方法學研究，為該原料質(zhì)量標準中制定細菌內(nèi)毒素檢查提供依據(jù)。

1、儀器與材料

1.1實驗材料

鱟試劑，靈敏度為0.125EU·ml-1，規(guī)格：0.1ml，批號2104091，湛江安度斯生物有限公司，批號20092512，福州新北生化工業(yè)有限公司;細菌內(nèi)毒素工作標準品，效價80EU·支-1，批號150601-210987，中國食品藥品檢定研究院;細菌內(nèi)毒素檢查用水50ml·瓶-1，批號：2005220，湛江安度斯生物有限公司;無水乙醇，批號2009231，西隴科學股份有限公司;吐溫80，批號：20210125，國藥集團。

1.2儀器

GZX-9246MBE電熱恒溫干燥箱（上海博迅實業(yè)有限公司醫(yī)療設備廠），XW-80A型漩渦混合器（上海滬西分析儀器廠有限公司），HH-8型恒溫水浴鍋（上海梅香儀器有限公司），XSR204型萬分之一天平（梅特勒-托利多），移液器（賽托利斯）。

1.3樣品

卡巴他賽，批號：598210401、598210402、598210501，山東新時代藥業(yè)有限公司。

2、方法與結(jié)果

2.1菌內(nèi)毒素限值的確定

根據(jù)企業(yè)內(nèi)控標準，確定原輔料的細菌內(nèi)毒素限值（總細菌內(nèi)毒素之和小于制劑限度）。質(zhì)量標準規(guī)定：每1mg卡巴他賽中含內(nèi)毒素的量應小于0.5EU·mg-1。

2.2鱟試劑靈敏度復核

按照《中華人民共和國藥典》2020版四部通則1143細菌內(nèi)毒素檢查法規(guī)定，進行鱟試劑靈敏度復核，結(jié)果見表1。兩批鱟試劑經(jīng)用細菌內(nèi)毒素國家標準品檢查，λc與λ均一致，結(jié)果均符合規(guī)定。

注：“-”為陰性結(jié)果 “+”為陽性結(jié)果

2.3最大有效稀釋倍數(shù)的計算

卡巴他賽供試品溶液的配制：稱取供試品60mg，加入1ml細菌內(nèi)毒素檢查用水，再加入3ml的無水乙醇，混勻使其溶解后加入1ml吐溫80，再次混勻后加入5ml細菌內(nèi)毒素檢查用水即得C=6mg·ml-1的供試品溶液。每次混勻不得少于30s。

最大有效稀釋倍數(shù)（Maximum valid dilution，MVD）MVD= CL/λ為根據(jù)，C為供試品溶液濃度6mg·ml-1，L為細菌內(nèi)毒素限值0.5EU·mg-1，λ為鱟試劑的靈敏度0.125EU·ml-1，則MVD=24倍。

2.4干擾實驗

按照《中華人民共和國藥典》2020版四部通則1143細菌內(nèi)毒素檢查法，用兩個廠家標示靈敏度為0.125EU·ml-1的鱟試劑進行干擾試驗。根據(jù)數(shù)據(jù)計算MVD=24倍，選擇24倍進行干擾試驗。

稱取供試品60mg，共稱取四份，每份分別加入1ml含60EU/ml、30EU/ml、15EU/ml、7.5EU/ml標準內(nèi)毒素溶液及3ml的無水乙醇，溶解混勻后每份再加入1ml吐溫80，再次混勻后每份分別加入5ml細菌內(nèi)毒素檢查用水即得含有系列標準內(nèi)毒素的供試品溶液。分別將上述四份溶液均用細菌內(nèi)毒素檢查用水稀釋24倍（每步稀釋不得多于10倍），制成含內(nèi)毒素濃度為0.25、0.125、0.06、0.03EU·ml-1的供試品溶液。

用細菌內(nèi)毒素檢查用水將細菌內(nèi)毒素工作標準品制成濃度為0.25、0.125、0.06、0.03EU·ml-1的內(nèi)毒素標準溶液;同時進行陰性對照。根據(jù)公式antilg（∑X/4）分別計算出內(nèi)毒素標準溶液和含供試品的內(nèi)毒素溶液的反應終點濃度的幾何平均值，試驗結(jié)果見表2。

從以上干擾結(jié)果，內(nèi)毒素標準溶液的反應終點濃度的幾何平均值均在0.5λ～2λ之間，含供試品的內(nèi)毒素溶液的反應終點濃度的幾何平均值均在0.5λ～2λ之間，24倍供試液對鱟試劑與細菌內(nèi)毒素反應無干擾作用。

2.5供試品內(nèi)毒素檢測結(jié)果

將三批供試品分別稱取60mg，加入1ml細菌內(nèi)毒素檢查用水，再加入3ml的無水乙醇，混勻使溶解后分別加入1ml吐溫80，再次混勻后分別加入5ml細菌內(nèi)毒素檢查用水即得供試品溶液。用細菌內(nèi)毒素檢查用水稀釋24倍后制成供試品溶液;按照《中華人民共和國藥典》2020版四部通則1143細菌內(nèi)毒素檢查法，進行細菌內(nèi)毒素檢查，結(jié)果見表3。三批供試品細菌內(nèi)毒素均符合規(guī)定，即內(nèi)毒素含量小于0.5EU·mg-1。

3、討論

細菌內(nèi)毒素隨注射劑進入人體血液所導致的“熱源反應”是注射劑臨床應用中發(fā)生率較高的不良反應，細菌內(nèi)毒素是注射劑質(zhì)量檢查的重要項目。卡巴他賽作為注射劑原料，從生產(chǎn)源頭控制細菌內(nèi)毒素。本文按照《中華人民共和國藥典》2020版四部通則1143“細菌內(nèi)毒素檢查法—凝膠法”進行細菌內(nèi)毒素檢查法研究，結(jié)果表明卡巴他賽用溶劑溶解混勻后，經(jīng)24倍稀釋對細菌內(nèi)毒素檢查無干擾作用，可在大于或等于此稀釋倍數(shù)下采用凝膠法進行卡巴他賽的細菌內(nèi)毒素檢查，從而控制供試品的內(nèi)毒素含量在限值范圍內(nèi)，保證產(chǎn)品質(zhì)量，確保患者用藥安全。

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