常規(guī)透射電鏡生物樣品制樣條件的摸索總結(jié)

黃靜，彭彬

(川北醫(yī)學(xué)院形態(tài)學(xué)研究所電鏡結(jié)構(gòu)研究室，四川 南充 637000)

實驗樣品的選擇制作是臨床及科研工作的重要環(huán)節(jié)，取樣時樣品大小、取樣部位、取樣后固定液的選擇、固定時間等對實驗成敗至關(guān)重要。而樣品制作中，鋨酸配制和使用方法、包埋劑的選擇、滲透時間溫度設(shè)置、組織修塊、超薄切片室的環(huán)境條件、染色處理等，會對實驗結(jié)果產(chǎn)生較大影響。如何保證樣品的質(zhì)量是電鏡工作技術(shù)人員面臨的實際問題。現(xiàn)將樣品的取材固定及后期處理的關(guān)鍵技術(shù)和注意事項予以總結(jié)，以期望為臨床和科研人員提供一些幫助。

1 常規(guī)透射電鏡樣品的取材及固定

1.1 取材要求及注意事項

“快、小、利、凈、準(zhǔn)、冷”是取材的基本要求。“快”是為了避免組織細(xì)胞因缺血缺氧導(dǎo)致自溶，破壞超微結(jié)構(gòu)；“小”由于電鏡使用的固定液戊二醛的滲透速率慢(僅為0.5 mm/h)，為避免固定不充分，取材大小以1 mm3為宜；“利”是取材工具要鋒利，以避免取材工具來回拉扯組織造成人為假象；“凈”是避免組織取材時殘留血跡污跡，影響實驗結(jié)果；“準(zhǔn)”是針對取材的部位要準(zhǔn)確，尤其是需要定位的組織(腸道、呼吸道、眼組織、皮膚、神經(jīng)等)[1]；“冷”可以降低酶活性，避免組織細(xì)胞因環(huán)境溫度、固定液溫度而加速自溶，破壞超微結(jié)構(gòu)。因此，所用實驗容器、溶液和器械均需要預(yù)冷。以上各個環(huán)節(jié)均會影響到最終實驗結(jié)果[2-3]。

1.2 固定液的選擇

固定的作用是盡可能使組織和細(xì)胞接近其生存時的狀態(tài)，減少動物死亡后組織細(xì)胞的變化，使細(xì)胞器的精細(xì)結(jié)構(gòu)完好無損的保存下來，同時使細(xì)胞內(nèi)各種成分固定，避免在后續(xù)操作中因沖洗、脫水等環(huán)節(jié)的溶解和消失。電鏡制樣過程中，常用的固定液為戊二醛和鋨酸，起前后固定作用[4]。戊二醛對細(xì)胞精細(xì)結(jié)構(gòu)具有很強的親和力，在使用過程中應(yīng)該避光、密封、低溫(4 ℃)保存，并且需要充分漂洗后才能轉(zhuǎn)入后固定液鋨酸中。鋨酸作為后固定液，它和氮原子具有較強的親和力，對細(xì)胞中的蛋白質(zhì)成分具有良好的固定作用，同時還具有電子染色作用，是生物透射電鏡技術(shù)中廣泛使用的固定液。但鋨酸具有極強的揮發(fā)性、劇毒，對人體的呼吸道、粘膜和皮膚等具有損傷，因此需要在通風(fēng)櫥中進行操作。同時鋨酸受熱和光極易揮發(fā)，需要避光4 ℃保存，再者它是一種強氧化劑[5]，要求在配制過程中使用到的所有器皿都要洗凈(酸缸浸泡)、烘干備用。

2 常規(guī)透射電鏡樣品的制備

2.1 實驗室環(huán)境條件要求

實驗室環(huán)境條件包括了實驗室的溫濕度、實驗用水[6]、環(huán)境通風(fēng)及危險有害化學(xué)物品保存條件。溫濕度條件對取樣、后固定、環(huán)氧樹脂配制、滲透、聚合、切片、染色等步驟均有影響。實驗用水體現(xiàn)在試劑的配制，尤其是檸檬酸鉛染液的配制，鉛鹽極易與空氣和水中的二氧化碳結(jié)合產(chǎn)生碳酸鉛沉淀從而污染切片，在電鏡下呈黑色致密的圓形或不定形顆粒，影響電鏡觀察。戊二醛、鋨酸、環(huán)氧樹脂、環(huán)氧丙烷等都具有揮發(fā)毒性，通風(fēng)措施是保障整個實驗過程中上述有害物品釋放的安全。此外，危險化學(xué)物品，特別是醋酸雙氧鈾染色劑，因具有放射性，需要鉛罐保存以保障安全。

2.2 制備過程中的注意事項

2.2.1 包埋劑的選者及使用注意事項 通常選用環(huán)氧樹脂作為電鏡樣品的包埋劑，其具有聚合縮合小、對組織損傷小、耐電子轟擊等特點。環(huán)氧樹脂有兩種化學(xué)反應(yīng)基團，其結(jié)構(gòu)鏈的兩端有環(huán)氧基，鏈中有羥基，因此將樹脂和含有胺、酸酐的硬化劑(DDSA和MNA)和加速劑(DMP-30)三者按照一定的比例混合加溫，就會產(chǎn)生二維聚合，形成穩(wěn)定、抗熱、抗溶的惰性物質(zhì)[7]。包埋劑的配制和使用過程中需要注意控制環(huán)境濕度，因為包埋劑極容易受潮導(dǎo)致樣品不能得到很好的浸透與聚合，影響交聯(lián)反應(yīng)的發(fā)生，切片時易形成褶皺和顫痕，導(dǎo)致切片破碎不全。配制中，以環(huán)境溫度25 ℃、環(huán)境濕度50%左右為宜，可利用除濕機及空調(diào)等設(shè)備保持室溫和濕度。配制好的包埋劑在低溫干燥密封條件下可以保存數(shù)月。在攪拌混合包埋劑時，要防止氣泡產(chǎn)生，配制好后靜置30 min再使用[8]。加速劑DMP-30需要用量準(zhǔn)確，過多會使組織塊變硬，過少會使組織變軟，均不利于切片[9]。使用剩余的包埋劑可以存放于-20 ℃保存數(shù)月，但應(yīng)避免反復(fù)凍融。另外，凡是涉及到樹脂環(huán)節(jié)，如有條件，應(yīng)使用微波處理，這樣包埋效果會更好[10]。

2.2.2 修塊技術(shù)及注意事項 修塊是把從包埋模具取出的包埋塊通過手工或者修塊機去掉多余的樹脂，從而暴露出超薄切片所需組織塊。手工修塊一般用單面刀片傾斜45°向外粗修出四個斜面，使包埋塊頂端呈現(xiàn)錐體形狀，然后再將頂面修平。修塊機原理同手工。最后修成的組織塊頂端截面呈等腰梯形，四邊光滑平整，才有利于切出連續(xù)的帶形切片，切片之間所形成的夾角也更容易用睫毛筆斷片，便于切片的撈取。修塊刀片須經(jīng)常更換，并注意不要劃傷手指。修塊機需要經(jīng)常清潔吸塵器或更換過濾網(wǎng)，避免長期積累的樹脂堵塞吸塵器導(dǎo)致不能正常工作，導(dǎo)致在修塊時大量樹脂余留組織塊上，影響超薄切片[11-12]。

2.2.3 超薄切片技術(shù)及注意事項 超薄切片是用超薄切片機，將修塊好的組織塊切成70～100 nm厚的薄片，包括了制作玻璃刀、上樣、上刀、對刀、加水、切片和撈片等環(huán)節(jié)。玻璃刀的制作需經(jīng)過長期反復(fù)練習(xí)，要注意玻璃條對半折斷時力度在5以下，自然斷裂為佳。良好的玻璃刀在解剖顯微鏡下觀察刀刃為一條光滑的亮線，沒有鋸齒，應(yīng)力線明顯。如果發(fā)現(xiàn)某一段呈鋸齒狀且有閃爍的光點，則這一段刀鋒稍差，只能用來修塊或半薄切片。玻璃刀最好現(xiàn)制現(xiàn)用，避免灰塵[13]。鉆石刀的使用需特別小心，因其價格昂貴，建議在熟練掌握玻璃刀使用的基礎(chǔ)上使用，并注意鉆石刀使用前后的清潔，對刀時要輕拿輕放，防止碰撞。切片時須將已經(jīng)修塊的包埋塊的長邊成水平放置，并讓長邊在下，將刀鋒與與樣品保持一定距離，然后慢慢進刀。在暗視野下觀察到刀和組織塊間有一條大小均勻的亮光出現(xiàn)后，在刀槽中慢慢加水至觀察到水面反光為止，水必須干凈[14]。切片速度一般為2～5 mm/s，厚度為50～100 nm。通過切片顏色來觀察切片厚度，藍(lán)紫色太厚，暗灰色太薄，均不能使用，而微黃色偏厚，銀灰或者銀白者適中，可以使用。在實踐過程中，切片常常會出現(xiàn)褶皺、震顫、切空片、跳片、散片等情況，是由于前期樣品制備過程處理不得當(dāng)所致，比如滲透不完全、修塊切面不平整、刀刃刀槽不干凈、空氣中濕度過大、環(huán)氧樹脂吸潮、環(huán)境中的灰塵等[15-18]，因此，超薄切片機須置于潔凈、恒溫、防震動的環(huán)境中。在切片過程中應(yīng)避免人員走動，以減少灰塵污染切片的機會[19-20]。撈片操作需要豐富的經(jīng)驗，必須耐心謹(jǐn)慎，保持手持銅網(wǎng)穩(wěn)定。另外，須注意選擇質(zhì)量良好的銅網(wǎng)。

2.2.4 染色技術(shù)及注意事項 染色是利用重金屬染色劑(鈾和鉛)與細(xì)胞結(jié)構(gòu)的結(jié)合能力不同，增加樣品局部的電子散射能力，提高圖像反差。鈾可以結(jié)合細(xì)胞中大多數(shù)成分，提高核酸、蛋白質(zhì)和結(jié)締組織的反差，且對細(xì)胞各結(jié)構(gòu)均有親和力，尤其是提高膜結(jié)構(gòu)和脂類物質(zhì)的反差，對糖原和核糖體等著色。超薄切片通常采用醋酸雙氧鈾和檸檬酸鉛雙重染色。醋酸雙氧鈾在配制使用時，需要用純水或者新鮮蒸餾水，避免水長時間放置酸化，增加二氧化碳含量，因為鈾對光和高溫具有不穩(wěn)定性，故需貯藏于棕色瓶和4℃的冰箱內(nèi)。醋酸雙氧鈾每次配制少量，一般使用2～3個月后需重新配制。優(yōu)質(zhì)的染色液應(yīng)具黃綠色熒光，如放置時間過長，易水解生成堿性鹽而呈黃白色水合物，此時黃綠色熒光消失，容器底部易形成沉淀，因此，每次使用前最好先離心，去除沉淀。檸檬酸鉛在配制使用時，所用的水必須要去除二氧化碳，避免二氧化碳和鉛反應(yīng)生成碳酸鉛。碳酸鉛顆粒在電鏡下呈現(xiàn)為黑色致密的圓形或者不規(guī)則顆粒，從而影響觀察。檸檬酸鉛染液在配制時需用氫氧化鈉將PH值調(diào)節(jié)為12，保存時需要隔離空氣，出現(xiàn)沉淀則需要廢棄。使用醋酸雙氧鈾和檸檬酸鉛染色后均需要漂洗干凈，但是漂洗的力度不易過大，避免將切片沖洗掉[20]。染色的溫度和時間隨地域和季節(jié)差異及實驗室條件不同各有不同，當(dāng)室溫為25 ℃左右，醋酸雙氧鈾染色15 min，檸檬酸鉛染色30 min較為適合。漂洗后待自然干燥方可上機觀察。

3 小結(jié)

常規(guī)透射電鏡樣品的制備過程是一項精細(xì)繁瑣而又技術(shù)性很強的工作，本研究小組經(jīng)過多年反復(fù)摸索認(rèn)識到在整個操過程中，任何一個細(xì)節(jié)沒有做到位，任何一個條件不滿足，都難以得到理想的電鏡結(jié)果。因此，在樣品制備前一定要做好充分準(zhǔn)備，熟知每一個步驟的原理及注意事項，盡量避免可能導(dǎo)致結(jié)果失敗的因素，才能最終得到自己想要的結(jié)果，得到客觀準(zhǔn)確的實驗數(shù)據(jù)。