RGMa在多發性硬化中的研究進展*

湯金華，楊 軍，鞠 露 綜述，馮金洲 審校

(重慶醫科大學附屬第一醫院神經內科，重慶 400016)

多發性硬化(MS)是一種中樞神經系統(CNS)炎性自身免疫性疾病，主要病理表現為炎性細胞浸潤、脫髓鞘繼而軸突破壞。發病以青少年多見，常導致永久性軀體功能殘疾，是30歲以下年輕人最常見的致殘性CNS疾病之一，全世界超過250 萬例患者，給家庭和社會造成沉重的負擔[1]。然而，目前MS具體發病機制未明，缺乏生物學標志物，阻礙靶向治療的臨床應用。目前研究表明，排斥性導向分子a(RGMa)可能參與CNS多種疾病的病理機制，尤其是MS的發病[2-3]。

1 RGMa分子結構

RGMa屬糖基磷脂酰肌醇(GPI)錨定的蛋白家族成員，最早被發現于雞胚胎視覺系統，具有軸突導向功能[4]。目前在脊椎動物中發現排斥性導向分子(RGMs)家族成員主要有RGMa、RGMb和RGMc 3種形式，RGMa和RGMb以基本上不重疊的方式主要表達于CNS及其他組織(心臟、肺、肝臟、皮膚、免疫系統及小腸等)，而RGMc 僅表達于骨骼肌、肝臟和血液。RGMa基因定位于15q26.1號染色體，所編碼蛋白含450個氨基酸，具有GPI錨定的C端、N端信號肽，RGD基序及部分von Willebrand D型(vWFD)結構域4個組成部分。RGMa以可溶性、膜結合形式存在于神經元、髓鞘等CNS結構[5]。

2 RGMa的信號傳導通路

RGMa同1型跨膜蛋白Neogenin結合，主要經Rho-Rho激酶途徑，發揮軸突引導或神經元存活、血管生成等生物學功能；RGMa的C端結構域(C-RGMa)和RGMa的N端結構域(N-RGMa)激活了不同的細胞內途徑來調控上述功能：通常C-RGMa與Neogenin結合可通過Unc5和LARG激活RhoA，C-RGMa通過RhoGEF(LARG)/Rho/Rock途徑抑制軸突生長；通過黏著斑激酶(FAK)和p120 RasGAP滅活Ras，從而誘導生長錐塌陷[5-6]。而C-RGMa與Neogenin的結合抑制了Lrig2和Neogenin之間的相互作用，ADAM17可切割Neogenin，以使神經元對RGMa不敏感;N-RGMa依賴于β分泌酶切割Neogenin的細胞內部分，以生成細胞內結構域，該結構域通過結合LIM蛋白4(LMO4)來阻止神經生長[5-6]。在上皮細胞中，Neogenin結合并定位WAVE調節復合物(WRC)，導致肌動蛋白在Arp2/3復合體的幫助下成核并進一步聚合為微絲，同時需要Rac1來激活和穩定的黏附連接，該通路可調節細胞間黏附連接，維持CNS發育的保真度[5]。此外RGMa作為骨形態發生蛋白(BMPs)的共受體，可作為BMP和Neogenin之間的結構橋，可與BMP-2、BMP-4等分子結合后通過BMP-BMP受體通路，誘導BMP受體復合物的內吞作用，從而激活經典的SMAD信號傳導，參與鐵代謝、骨骼發育、軸突再生等過程[7-8]。

3 RGMa的生物學活性

3.1細胞增殖與分化 RGMa與Neogenin均在腸道神經干細胞增殖及分化過程中高表達，二者任一缺失會引起腸道系統神經元、神經節、膠質細胞減少，表明RGMa參與細胞增殖與分化[9]。

3.2細胞黏附與遷移 RGMa可提高離體胚胎的細胞間黏附作用；RGMa過表達的早期胚胎的外胚層細胞出現遷移缺陷，表明RGMa與細胞黏附、遷移相關[8]。

3.3神經發生與神經管閉合 RGMa與Neogenin結合后可調節胚胎神經發生中的分化和遷移，在體外RGMa與Neogenin可共同調節成人CNS發生[10-11]。RGMa誘導Neogenin蛋白水解促進神經管形態發生，耗竭RGMa可引起神經管閉合缺陷[12]。

3.4調控神經元存活 敲除齒狀回中的RGMa可增加新生神經元的數目。有學者認為RGMa與神經干細胞上的Neogenin結合，通過調控caspase-3、ROCK、死亡相關蛋白激酶(DAPK)和LMO4等調節CNS神經元存活[10-11]。

3.5抑制突觸形成 RGMa可通過干擾皮質神經元中突觸前蛋白synapsin-1與突觸后蛋白PSD-95的同區域表達以阻礙突觸形成；抑制RGMa可使以上兩種蛋白的共表達提高，從而提高脊髓損傷后的突觸形成[13]。

3.6生長錐塌陷及軸突生長抑制 RGMa可能通過誘導RhoA和ROCK在CNS損傷后起到軸突生長抑制作用[5,14]。RGMa通過激活Rho-kinase及GSK-3β通路調控塌陷反應介體蛋白-2(CRMP-2)的磷酸化，導致生長錐塌陷[15]。抑制RGMa可以促進脊髓損傷后軸突生長和運動恢復[13,16-18]。

3.7免疫調節 RGMa可通過樹突狀細胞(DCs)調節T細胞活化和自身免疫反應，促進炎癥細胞的CNS浸潤[19]。用RGMa中和抗體處理，可讓DCs發揮耐受性和免疫調節功能，降低主要組織相容性復合體-Ⅱ(MHC-Ⅱ)、CD86、CD80和CD40水平，從而減輕自身免疫反應[20]。

3.8抑制新生血管形成 RGMa與血管內皮細胞上Neogenin結合，可降低磷酸化FAK水平、下調血管內皮生長因子(VEGF)、抑制 F-肌動蛋白，從而明顯降低內皮細胞的增殖、遷移和血管生成[5,21]。RGMa在體外、體內均可抑制血管生成[21-22]。

3.9調控血腦屏障(BBB)通透性 沉默RGMa表達可改善BBB破壞，從而減少腦梗死大鼠梗死、水腫體積，推測RGMa可能通過CDC-42/PAK-1信號通路參與了BBB功能障礙[23]。

4 RGMa在MS中的研究進展

4.1RGMa在MS中的表達 研究發現MS動物模型實驗性自身免疫性腦脊髓炎(EAE)小鼠發病后RGMa水平明顯升高，并且在繼發進展型MS(SPMS)小鼠模型中，處于疾病繼發進展階段小鼠的脊髓RGMa的表達也明顯高于對照組，與急性階段的表達水平相比，仍無明顯下降，表明RGMa參與EAE小鼠的急性發病與繼發進展[3]。DEMICHEVA等[7]發現SPMS患者CNS急、慢性損傷斑塊及正常樣白質均伴有RGMa表達的顯著升高?；€血液中RGMa表達水平與MS患者隨訪擴展殘疾狀態量表(EDSS)變化呈負相關，表明血RGMa的表達與MS神經功能缺損相關，RGMa有望作為MS臨床監測的生物標志物，指導臨床治療[2]。

4.2RGMa中和抗體在MS治療中的潛在作用 RGMa中和抗體在體內、體外均可抑制RGMa的表達，目前多項研究表明在多種MS動物模型EAE小鼠中，RGMa中和抗體可通過阻斷RGMa改善疾病神經功能評分，減輕髓鞘少突膠質細胞糖蛋白(MOG)誘導的EAE的臨床嚴重性，減少髓鞘蛋白脂質蛋白(PLP)誘導的EAE的復發，抑制繼發進展型EAE的進展，并從多個方面改善EAE的病理反應[3,5]。目前研究表明RGMa中和抗體可能主要從以下方面發揮治療作用。

4.2.1減輕炎性反應 用抗RGMa抗體治療急性、慢性EAE小鼠可減少CD4+T細胞等炎癥細胞向CNS的入侵，減少EAE小鼠CNS中INF-γ、IL-2、IL-17、IL-4等炎性細胞因子的表達水平，減輕炎性脫髓鞘程度，抑制CNS的炎性反應，減輕致病性Th17誘導的神經元損害[3,5]。在人類中，RGMa特異性抗體可降低患有MS個體的外周血單個核細胞(PBMC)中的T細胞增殖和促炎性細胞因子的產生[5,24]。

4.2.2減輕神經變性及增強軸突與髓鞘再生 用RGMa特異性抗體對脊髓炎型EAE大鼠進行全身治療，可增強炎性病變軸突再生的能力，并產生髓鞘再生跡象[7]。此外，人源化抗RGMa單克隆抗體治療繼發進展型EAE小鼠，可保留髓磷脂，抑制脫髓鞘和軸突變性，并促進皮質脊髓束(CST)的軸突生長和運動恢復，從而抑制疾病進展[3]。在視神經炎型EAE模型中，系統性應用RGMa特異性抗體可顯著減少視網膜神經纖維層(RNFL)的變性[7]?？筊GMa治療有非常強的神經保護作用。

4.3RGMa在MS中的發病機制 RGMa會高表達于MS損傷部位，通過特異性中和RGMa，神經功能進一步恢復，表明RGMa可作為MS有前景的生物標志物及治療靶點[2-3]。最近研究表明RGMa在MS的病理過程中具有重要作用，但具體機制尚不確切，RGMa在MS中可能的發病機制包括以下幾方面。

4.3.1介導免疫細胞信號轉導異常 在MS中，免疫細胞會滲透到CNS，其中細胞免疫發揮主導作用，從而導致脫髓鞘、軸突損傷和神經功能障礙等[25]。CD4+T細胞是CNS炎癥的關鍵效應細胞，目前普遍將分泌INF-γ的CD4+Th1細胞作為MS異常自身免疫反應的關鍵[6]。 目前研究發現RGMa的阻斷抗體不但能減少T細胞的增殖，而且可增強Th1細胞向具有自身免疫抑制作用的Th2細胞的轉化，RGMa在MS免疫反應中的新作用最近備受關注[20]。

RGMa-Neogenin信號通路可參與MS中T細胞介導的自身免疫過程[3]。具有較強抗原遞呈功能的骨髓來源的DCs可表達RGMa，而Neogenin由CD4+T淋巴細胞表達，抗原遞呈細胞的RGMa與CD4+T細胞的Neogenin結合誘導了小GTPase Rap1的激活，從而增加了對細胞內黏附分子1(ICAM-1)的黏附，因此，與Neogenin誘導的生長錐塌陷(導致黏附力迅速喪失)相反，RGMa和Neogenin在免疫細胞上的結合可以觸發增強的附著力，ICAM-1黏附的增加可促進免疫細胞向MS腦的侵襲，增強CNS炎性反應[19]。CD4+T細胞在SPMS和慢性EAE的慢性神經炎癥中也發揮著重要作用，抗RGMa抗體治療可顯著減少繼發進展型EAE小鼠脊髓切片中的細胞浸潤，并通過流式細胞術分析確定抗RGMa抗體可減少脊髓中CD4+T細胞和小膠質細胞的數量[3]。

目前研究發現RGMa在EAE中可誘導T細胞活化，激活后的T細胞可穿透BBB,大量分泌炎性細胞因子，募集更多炎性細胞，引起CNS異常自身免疫反應[5,24]。通過RGMa特異性抗體抑制RGMa的表達，可抑制T細胞反應，能夠顯著減少EAE小鼠CNS中INF-γ、IL-2、IL-17、IL-4等炎性細胞因子的表達，減輕脫髓鞘程度，緩解神經功能損傷，減弱EAE的嚴重程度；在人類，RGMa特異性抗體可降低患有MS個體PBMC中的T細胞增殖和促炎性細胞因子的產生，由此推測，RGMa-Neogenin信號轉導通路參與MS的T細胞介導的自身免疫過程：抗原遞呈細胞中的RGMa與Neogenin陽性的CD4+T結合，從而導致周圍神經系統和CNS的CD4+T細胞活化[5,25]。

最近研究表明，CD4+T中產生IL-17的Th17細胞在EAE發病機制中也起著重要作用，IL-17、IL-17受體的缺乏會減少EAE的臨床體征，而在包括Th0、Th1、Th17和Treg細胞在內的T細胞亞群中，Th17細胞高度表達RGMa，致病性Th17主要在MS中誘導神經變性：Th17細胞的RGMa與神經元中的Neogenin結合，通過AKT的去磷酸化誘導神經變性，RGMa的中和抗體可減輕軸突變性和Th17細胞介導的EAE的嚴重程度[24]。

綜上，RGMa-Neogenin信號轉導通路通過DCs、CD4+T細胞(主要為Th1、Th17)在MS的異常自身免疫中占據重要作用，可作為MS免疫治療的重要靶點。

4.3.2促進脫髓鞘 脫髓鞘在MS的病理中占據主要作用，在MS的經典動物模型EAE小鼠中，RGMa可通過增強CD4+T細胞的活化，促進CNS脫髓鞘[25]。本課題組前期研究發現利用RGMa中和抗體抑制RGMa表達能減輕EAE小鼠的脫髓鞘水平，抑制神經功能損傷。表明RGMa在EAE中可促進脫髓鞘，而RGMa在MS患者中是否能發揮脫髓鞘作用及RGMa中和抗體是否可減輕MS患者的脫髓鞘情況尚需進一步研究。

4.3.3促進神經變性 神經變性是MS進展的重要因素，在MS中極大影響神經功能恢復，軸突生長與髓鞘再生是目前促進MS功能恢復治療的熱點，在腦和脊髓中存在的RGMa具有強大的抑制再生活性，表明其可能在MS相關的神經變性中起關鍵作用[7]。研究表明，具有高度炎癥活性的小膠質細胞和巨噬細胞在進展性MS中起重要作用，而小膠質細胞可表達RGMa[3]。 用RGMa特異性中和抗體5F9，可結合RGMa的N端結構域，對脊髓炎型EAE大鼠進行全身5F9治療，可顯著且高度可重復地改善神經功能，減少小膠質細胞病變的大小，增強炎性病變軸突再生的能力，可促進脊髓灰質損傷部位及順行追蹤的CST的軸突出芽，并產生髓鞘再生跡象[7,26]。對于SPMS小鼠,抗RGMa抗體治療可通過抑制少突膠質細胞和小膠質細胞中RGMa表達，抑制脊髓中的軸突變性，降低脫髓鞘作用，并可通過促進損傷部位的CST軸突發芽而發揮再生神經網絡的能力，促進運動功能恢復，表明RGMa很可能在MS中具有促進軸突變性的作用，并推測可能通過RGMa-Neogenin通路發揮該作用[3]。

在20%～30%的患者中，MS的最初癥狀之一是視神經炎，即視神經的炎性發作，這種發作很可能會對形成RNFL的視網膜神經節細胞(RGC)及其軸突產生重大影響[25]。 研究發現在視神經炎型EAE模型中，系統性應用RGMa特異性中和抗體5F9可刺激軸突再生，使再生的軸突生長為炎性病變，顯著減少RNFL的變性，對RGC發揮顯著而強大的保護作用，還顯著增加了破裂視神經中髓磷脂堿性蛋白(MBP)+染色的面積，該表現可作為反映髓鞘再生的公認標志，這表明RGMa不僅參與軸突再生的抑制，而且參與細胞死亡的調控[7,26]。

綜上研究表明RGMa(尤其是RGMa的N端結構域)很可能促進MS的再生失敗與神經退行性變，但尚需進一步的臨床實驗來驗證RGMa在MS患者中的這一功能。

4.3.4抑制血管生成 血管生成是MS病理生理學涉及的另一個重要因素，在MS炎癥性病變中可見新血管形成，血管生成在MS疾病早期可通過消耗過多能量、促進炎癥擴展而產生有害作用，但新生血管釋放的營養因子可能對功能恢復帶來積極作用，如源自新血管的VEGF在EAE的早期階段表現出促炎作用，但在EAE的晚期階段參與修復過程；從新血管中產生的前列腺素I2(PGI2)可促進EAE中的運動恢復[24]。而在存在VEGF的情況下，RGMa可通過Neogenin抑制內皮管的形成，從而抑制新血管形成，表明RGMa-Neogenin信號傳導途徑可通過抑制血管生成影響MS的病理過程[21]。

4.3.5調控BBB通透性 在MS中，BBB的破壞是一個明顯且早期的病理特征[27]。RGMa在CNS中具有調控BBB通透性的功能[23]。MLLER等[28]發現，給MS患者鞘內注射曲安奈德，治療有效患者其神經功能改善程度與腦脊液RGMa水平降低程度呈一致趨勢，而治療無效的患者其腦脊液RGMa水平較治療前亦無明顯改善。同時基于抑制炎性細胞浸潤、改善BBB通透性是曲安奈德治療MS的主要機制之一，推測RGMa可能通過調控MS患者BBB通透性改變參與MS的病理過程[29]。

5 結語與展望

RGMa作為一種軸突導向分子，通過RGMa-Neogenin、RGMa-BMPs等信號通路廣泛參與CNS發育與病理過程。RGMa具有調控細胞增殖、分化、黏附、遷移、神經發生、神經管閉合、神經元凋亡、突觸形成、生長錐塌陷、軸突生長抑制、免疫應答、新生血管形成、BBB通透性等生物學活性。目前研究發現，RGMa在MS患者和EAE小鼠的CNS中高表達,并可能通過介導免疫細胞信號轉導異常、促進脫髓鞘、促進神經變性、抑制血管生成、調控BBB通透性等途徑參與MS的發病機制。RGMa中和抗體可通過阻斷RGMa減少炎性反應，減輕CNS異常自身免疫，減輕神經變性及增強軸突與髓鞘再生等作用改善EAE的神經功能，表明RGMa可能是治療MS非常有前景的靶向標志物。但RGMa在MS中的具體發病機制及通過的具體信號通路目前尚未完全明確，缺乏RGMa相關的隨機對照臨床試驗，亟須更深入的機制與通路研究及大樣本隨機對照臨床試驗以驗證RGMa在MS中的發病機制并指導靶向RGMa的臨床治療。