口腔扁平苔蘚患者外周血中ASH1L及其相關調(diào)控因子表達與免疫功能相關性

王方方 汪 鷹 蔡 揚

1.貴州醫(yī)科大學口腔醫(yī)學院，貴州貴陽 550004；2.四川大學華西口腔醫(yī)院種植修復科，四川成都 610000；3.貴州醫(yī)科大學附屬口腔醫(yī)院牙周黏膜科，貴州貴陽 550004

口腔扁平苔蘚（oral lichen planus，OLP）是一種較常見的口腔黏膜慢性炎癥疾病，一般認為T 細胞介導的免疫應答紊亂在其發(fā)病機制起重要作用[1-3]。ASH1L是一種組蛋白賴氨酸甲基轉(zhuǎn)移酶，可負向調(diào)控白細胞介素（interleukin，IL）-6 分泌并參與多種基因的轉(zhuǎn)錄激活[4-5]。泛素編輯酶A20 是一種抗炎蛋白[6]，IL-6 為一種參與免疫反應的多功能細胞因子[7]，兩者在炎癥和免疫調(diào)節(jié)中發(fā)揮重要作用[8-10]。研究表明ASH1L可誘導活化A20，通過A20 的去泛素化修飾負向調(diào)控IL-6，保護機體抵抗自身免疫性疾病[11-12]。本研究通過分析OLP 患者外周血單個核細胞（peripheral blood mononuclear cell，PBMC）中ASH1L、A20、IL-6 表達與免疫功能的相關性，探討其在OLP 免疫發(fā)病機制中的作用及意義。

1 資料與方法

1.1 一般資料

收集2018 年8 月至2019 年8 月于貴州醫(yī)科大學附屬口腔醫(yī)院（以下簡稱“我院”）就診的40 例OLP初診患者（OLP 組），其中男14 例，女26 例；年齡18～71 歲，平均（41.6±7.9）歲。另選擇我院同期20 名體檢健康的志愿者（對照組），其中男12 名，女8 名；年齡20～54 歲，平均（37.0±6.4）歲。兩組性別、年齡比較，差異無統(tǒng)計學意義（P ＞0.05），具有可比性。納入標準：參照《口腔黏膜病學》[13]OLP 診斷標準，結合臨床表現(xiàn)和組織病理學檢查確診為OLP。排除標準：①1～3 個月內(nèi)使用過抗生素、糖皮質(zhì)激素等相關藥物；②伴有全身免疫系統(tǒng)性疾病；③妊娠及哺乳期女性。本研究經(jīng)我院醫(yī)學倫理委員會審批，受試者均知情同意。

1.2 檢測方法

反轉(zhuǎn)錄試劑盒（RR047A）、SYBRGreen 熒光定量試劑盒（RR820A）均購自大連寶生物有限公司；美國Bio-Rad CFX96 熒光定量PCR 儀、美國BD FACSCantoTMⅡ流式細胞儀。引物由上海生工生物工程有限公司設計并合成，見表1。抽取兩組空腹靜脈血5 ml，其中2 ml采用散射比濁法檢測體液免疫指標，另外3 ml采用乙二胺四乙酸抗凝，分別用于提取PBMC，應用流式細胞術分析淋巴細胞亞群百分比。采用實時熒光定量PCR 進行提取總RNA，總RNA 定量及純度檢測后按說明合成cDNA、配制PCR 反應體系，設置反應條件：95℃10 min，95℃10 s，60℃15 s，共40 個循環(huán)，采用2-△△Ct 法[14]對各基因進行相對定量分析。

表1 基因引物序列

1.3 統(tǒng)計學方法

采用SPSS 25.0 對所得數(shù)據(jù)進行統(tǒng)計學分析，正態(tài)分布的計量資料采用均數(shù)±標準差（）表示，組間比較采用t 檢驗，偏態(tài)分布計量資料的描述以中位數(shù)（四分位數(shù)）[M（P25，P75）]表示，組間比較采用Mann-Whitney U 檢驗。計數(shù)資料采用例數(shù)表示，組間比較采用χ2檢驗。以P ＜0.05 為差異有統(tǒng)計學意義。

2 結果

2.1 兩組細胞免疫指標水平比較

OLP 組中CD3+、CD3+CD4+、CD3+CD8+、總T+B+NK細胞水平均低于對照組，CD19+、CD4+/CD8+比值均高于對照組，差異有統(tǒng)計學意義（P ＜0.05）。見表2。

表2 兩組細胞免疫指標水平比較（）

表2 兩組細胞免疫指標水平比較（）

注：OLP：口腔扁平苔蘚

2.2 兩組體液免疫指標水平比較

OLP 組IgM 水平高于對照組，補體C3、C4 水平均低于對照組，差異有統(tǒng)計學意義（P ＜0.05）。見表3。

表3 兩組體液免疫指標水平比較（mg/L，）

表3 兩組體液免疫指標水平比較（mg/L，）

注：OLP：口腔扁平苔蘚

2.3 兩組ASH1L、A20、IL-6 mRNA 相對表達量比較

OLP 組ASH1L 及A20 mRNA 相對表達量低于對照組，IL-6 mRNA 高于對照組，差異有統(tǒng)計學意義（P ＜0.05）。見表4。

表4 兩組ASH1L、A20、IL-6 mRNA 相對表達量比較[M（P25，P75）]

2.4 OLP 組ASH1L、A20、IL-6 mRNA 相對表達量與免疫功能指標相關性分析

OLP 組ASH1L mRNA 相對表達量與IgG 水平呈正相關（r ＞0，P ＜0.05）。A20 mRNA 相對表達量與CD8+、IgA 水平呈正相關（r ＞0，P ＜0.05），與CD4+/CD8+呈負相關（r ＜0，P ＜0.05）。見表5。

表5 OLP 組ASH1L、A20、IL-6 mRNA 相對表達量與免疫功能指標相關性分析

3 討論

OLP 是一種以T 細胞浸潤為特征的自身免疫性疾病[15-17]，ASH1L 為高度保守的組蛋白甲基化轉(zhuǎn)移酶，通過A20 去泛素化修飾抑制IL-6 表達，在體內(nèi)具有保護作用[18-19]。本研究OLP 組PBMC 中ASH1L、A20相對表達量低于對照組，且二者呈正相關，提示隨ASH1L 表達減弱，局部炎癥微環(huán)境持續(xù)活化，其誘導A20 活化的能力下降而導致A20 相對表達不足，在機體內(nèi)所發(fā)揮的抗炎作用有限。二者表達水平下降可能是由于其向OLP 病損部位遷移，血液中相對缺乏表達ASH1L 與A20 的細胞，這與OLP 組二者表達水平下降的結果相一致[20]。本研究結果顯示，A20 表達下調(diào)，與在類風濕性關節(jié)炎等自身免疫性疾病中研究結果一致[9，21]。本研究提示ASH1L 表達水平下調(diào)、抑炎作用減弱時，IL-6 水平升高，OLP 炎癥程度隨之加重。IL-6 表達水平升高，提示PBMC 可能是OLP 患者血清IL-6 來源，反映了OLP 患者機體慢性炎癥狀態(tài)。研究[22-24]發(fā)現(xiàn)IL-6 過度合成可參與自身免疫性疾病發(fā)展過程，可作為檢測疾病活動的生物標志物。OLP組中A20 的表達水平與CD8+、IgA 呈正相關，與CD4+/CD8+呈負相關，推測A20 的表達下降與CD8+向局部病損組織遷移有關，A20 可能通過影響T 細胞功能參與OLP 特應性免疫應答過程。

綜上，本研究發(fā)現(xiàn)ASH1L 及相關調(diào)控因子在OLP 患者外周血PBMC 中表達異常且與免疫指標有關，在OLP 免疫發(fā)病機制中發(fā)揮了一定作用。