競爭性內源RNA在食管癌中的研究進展

李春震，馮豪雙，陳 嶺，趙鐵軍

(海軍軍醫大學附屬長海醫院胸外科，上海 200433)

食管癌是一種惡性程度極高的腫瘤，近年來世界范圍內的食管癌病例數上升明顯，并且我國的食管癌患者數量最為龐大[1],其中大部分為食管鱗癌(ESCC)。盡管近年來手術切除作為食管癌的關鍵治療手段取得了一定進展，但由于早期診斷率低、惡性程度高等原因，食管癌患者的5年生存率仍不理想[2]，因此研究有利于實現早診早治的診療模式和檢測手段極其重要。在腫瘤的發生發展過程中尋找靶點并進行干預是腫瘤研究的熱點方向之一，該過程中存在的蛋白質編碼mRNA和非編碼RNA的異常，尤其是數量龐大的非編碼RNA引起了研究者的廣泛關注[3]。非編碼RNA主要包括miRNA、lncRNA及cirRNA等，研究已表明這些RNA在結直腸癌[4]、胃癌[5]、乳腺癌[6]等腫瘤的發生發展及轉移等生物學行為中發揮作用，而在食管癌領域這些RNA的功能也在逐步被發掘。

2011年，SALMENA等[3]提出的ceRNA理論為研究RNA在腫瘤生物學行為中的作用提供了新的視角。其主要內容為：含有相同的miRNA應答元件(MREs)的內源性RNA分子，主要包括lncRNA、cirRNA、mRNA及假基因轉錄物等，可以競爭結合相應miRNA的特定位點實現調節作用，進而在轉錄后水平調控細胞的生長、增殖和分化等過程。而近年來基于ceRNA理論的食管癌研究取得了一定成果，從RNA-RNA相互作用進而調控下游生物效應的層面加深了人類對食管癌發生發展過程的認識，有望為今后食管癌的早期診斷、治療和預后評估等方面提供參考。本文就各種類型ceRNA在食管癌的發生發展過程中的作用及食管癌ceRNA網絡的研究情況進行綜述。

1 lncRNA作為ceRNA在食管癌中的作用

作為基因組中廣泛存在的一類長度大于200 bp的非編碼RNA，lncRNA具有可順式和反式調控基因表達的特點，并且在染色質重塑、轉錄后調控及影響腫瘤的發展進程等方面的功能備受研究者關注[7-8]。大量研究證實了lncRNA失調與腫瘤的生物學行為之間的關系，也證實了選取lncRNA作為食管癌研究的切入點的可行性。YU等[9]對79例食管腺癌(EAC)患者的腫瘤組織樣本進行分析，發現有561個癌癥相關lncRNA在EAC中的變化高于正常2倍以上(包括上調與下調)，其中包括AC007128.1等12個lncRNAs與總生存期呈負相關，而AC004585.1等在內的14個lncRNAs與總生存期呈正相關。LIU等[10]構建ceRNA網絡發現WDFY3-AS2、AC007128.1等8個lncRNAs與生存期相關。SONG等[11]對食管鱗癌(ESCC)的研究也發現了1384個lncRNA的變化，涉及7條上調mRNA的通路和10條下調mRNA的通路，影響腫瘤的細胞分裂周期和信號轉導等活動。

YU等[9]在研究中發現lncRNA CYP1B1-AS1和HOTAIR與生存期顯著相關，又是ceRNA網絡的重要部分，提示兩者在研究食管腺癌基因及患者預后方面的重要價值。HOTAIR是一類研究較多的腫瘤發生調節因子，在食管鱗癌組織中高表達并與腫瘤進展和患者的預后密切相關，可作為ceRNA結合miR-125和miR-143正向調節己糖激酶2(HK2)表達，進而發揮致癌作用[12]。此外，CCL18(癌細胞分泌的一種趨化因子)可上調HOTAIR水平，后者靶向作用于miR-130a-5p，導致ZEB1上調，促進食管癌的上皮-間質轉化(EMT)與惡性進展[13]。類似的研究也發現LncRNA UCA1[14]、SPRY4-IT1[15]、TUG1[16]、DANCR[17]、NEAT1[18]、TTN-AS1[19]等也在食管癌組織中明顯上調并且通過靶向不同的miRNA對下游效應分子產生去抑制作用，進而促進腫瘤增殖及預后惡化。如，LncRNA UCA1作為ceRNA有多個作用靶點，抑制miR-204對Sox4 mRNA的降解，抑制miR-498以增加ZEB2表達，進而促進腫瘤細胞增殖[14,20]。LncRNA DANCR與miR-33a-5p的相互作用也被發現，下游分子ZEB1促進食管癌細胞的增殖和轉移，而miR-33a-5p則抑制這種效應，但LncRNA DANCR可作為后者的分子海綿進而上調ZEB1的表達[17]。羧基末端結合蛋白2(CTBP2)是多種腫瘤發生、發展和侵襲等過程的重要調控因子，并且在ESCC組織高度表達，而miR-129可靶向抑制其效應，但lncRNA-NEAT1可解除后者的抑制作用，促進腫瘤進展[18]。lncRNA-XIST通過miR-494/CDK6軸導致食管癌的發生[21]，隨后YU等[22]通過構建模塊化的ESCC和頭頸部鱗癌(HNSCC)的共同ceRNA網絡發現，lncRNA-XIST還可能通過miR-6756-5p/C1QA影響患者預后，提示了ESCC和HNSCC在分子層面的潛在聯系。lncRNA Snhg1也是通過減輕miR-338-3p對原癌基因CST3的抑制效應來促進細胞增殖，但lncRNA Snhg1與其他分子海綿的不同之處在于其不可降解[23]。YANG等[24]根據lncRNA和mRNA表達譜的差異將ESCC分為2個亞型，分別與miR-186介導的lncRNA-PVT1及miR-26b介導的lncRNA-LINC00240的失調有關，同時lncRNA-PVT1可以作用于miR-203促進腫瘤進展[25]。

基因間長鏈非編碼RNA(LincRNA)作為ceRNA影響細胞功能的研究也逐漸出現，多條調控通路顯示了ESCC進展中的ceRNA機制。LINC-ROR可作為miR-145的分子海綿發揮對FSCN1的去抑制作用，且LINC-ROR/miR-145/FSCN1通路參與ESCC的侵襲和轉移[26]。LINC01518敲除后miR-1-3p水平上調，進而抑制PIK3CA/Akt通路，降低了鱗癌細胞的致瘤性[27]。LINC00657/miR-615-3p/JunB通路也參與ESCC的侵襲過程，并且LINC00657的上調可能與其放射抗性有關，下調LINC00657可明顯提高放療的敏感度[28]。食管鱗癌患者血漿中LINC00152水平較正常者明顯升高，且其水平與食管癌的TNM分期和淋巴結轉移等相關，LINC00152/miR-153-3P/FYN通路、LINC01980/miR-190a-5p/MYO5A通路等對ESCC進展的作用也被近期研究所發現[29-30]。

2 circRNA作為ceRNA在食管癌中的作用

circRNA也屬于非編碼RNA，是一類通過3’端和5’端的共價連接而形成的閉合環狀內源性RNA分子，以高度的穩定和保守性在眾多物種中廣泛存在。circRNA具有可在組織或疾病狀態下差異表達、發揮“miRNA海綿”作用并調節轉錄和翻譯過程等特點，也在ceRNA網絡中發揮調控miRNA活性的功能[31]。有研究[32-33]發現hsa_circ_0006168、circ-HIPK3的表達與ESCC的TNM分期和淋巴結轉移呈正相關，兩者均可作為ceRNA結合miRNA發揮調控作用，hsa_circ_0006168結合miR-100調節哺乳動物雷帕霉素靶蛋白(mTOR)的表達，circ-HIPK3通過抑制miR-599進而上調c-myc表達，最終促進ESCC的進展和轉移。circ-ITCH的特殊性在于其在ESCC的表達通常較低，但可以通過結合miR-7、miR-17和miR-214等提高ITCH的水平，進而抑制Wnt/β-catenin途徑發揮抑癌的作用[34]。化療耐藥是晚期食管癌患者生存率不佳的重要原因之一，ZOU等[35]發現circRNA_001275在順鉑耐藥的ESCC中明顯升高，circRNA_001275可以與miR-370-3p結合進而上調Wnt7a的表達，促進順鉑耐藥。JIANG等[36]構建的circRNA相關ceRNA網絡中發現有34個circRNA可結合64個相關miRNA并調節94個mRNA的表達，涉及的靶基因與腫瘤的增殖和轉移等過程密切相關。

3 假基因作為ceRNA在食管癌中的作用

假基因具有與正常基因相似的DNA序列，但失去了蛋白質編碼功能。其功能在以往未能引起足夠的重視，但越來越多的研究[37-38]發現假基因及其轉錄物在腫瘤發生過程中具有重要調節作用。由于假基因轉錄物常與同源基因的RNA具備相似MRE，因此可作為ceRNA競爭吸附miRNA發揮下游調控效應。假基因PTENP1與常見的抑癌基因PTEN對應，PTENP1通過競爭miR-17-5p以減少后者對細胞因子信號轉導抑制因子(SOCS6)的下調，進而發揮抑制腫瘤生物活性的作用[39]。腫瘤抑制候選基因2(TUSC2)也是新發現的抑癌基因，其假基因為TUSC2P，兩者有89%的序列同源并且共享包括miR-17-5p、miR-608等多個miRNA的結合位點，TUSC2P同樣可以通過結合上述miRNA調節TUSC2表達，影響腫瘤的生長和侵襲[40]。食管癌組織中PTENP1、TUSC2P的表達水平均明顯降低，并且有望作為判斷TNM分期、淋巴結轉移及患者預后情況的標志物。另外，有研究[41]發現人抑制素基因(PHB)的假基因PHBP1在ESCC中過度表達，其轉錄物可通過與PHB的mRNA直接作用以促進PHB的表達，進而促進腫瘤進展，雖未發現miRNA參與該過程，但也為研究ESCC中的RNA調控機制提供了新視角。

另外，除了非編碼RNA可以作為ceRNA調控生物學功能，具備MRE的蛋白編碼mRNA也能在ceRNA網絡中發揮作用，并且mRNA的MRE主要位于其3’UTR。腫瘤細胞中具有相同MRE的不同mRNA分子，可通過競爭結合某種miRNA而相互作用，進而對腫瘤細胞的活動實現調節。在乳腺癌[42]、結直腸癌[43]等腫瘤的研究中有部分mRNA作為ceRNA調控其他蛋白表達的報道，但目前在食管癌研究中鮮有報道。但SU等[44]發現在食管癌組織中G6PD的表達明顯增高，并且G6PD mRNA的3’UTR可以結合miR-613，逆轉miR-613對基質金屬蛋白酶2(MMP2)和基質金屬蛋白酶9(MMP9)的抑制作用。Sun等[45]發現OTUB1的3’UTR能與miR-542-3p結合，并且OTUB1的表達可以穩定Snail，而當miR-542-3p過表達時Snail也降低，但這些過程是否存在ceRNA機制目前尚不清楚。

4 ceRNA網絡與食管癌分子標志物研究

基于ceRNA理論的RNA分子間的相互作用以調控腫瘤的進展和轉移等生物學行為的研究為食管癌的診斷和預后評估提供了一個新的思路。既往所建立的多是基于單一RNA分子的預測模型，可能在一定程度上限制了應用效果。如前文所述，多種lncRNA、circRNA等與miRNA及下游的效應分子構成促進或抑制腫瘤進展的調控通路，與腫瘤分期及患者預后等存在明顯關聯。SHI等[46]建立的基于多類型RNA的ESCC預后評分系統中，納入包括LINC01068、miR-552-5p、MLIP等多種RNA分子，以及LAN等[47]建立的mRNA-lncRNA預后評估模型，均顯示出較單一類型RNA預測模型更優的效果。他們雖然未深入研究這些RNA之間的相互作用，但是提示了利用多種RNA進行預后評估的可行性。CHEN等[48]發現以hsa-miR372為中心的mRNA-CADM2/lncRNA-ADAMTS9 AS2及以hsa-miR145為中心的mRNA-SERPINE/lncRNA-PVT1在食管癌的發生發展中發揮作用，并且聯合檢測以上ceRNAs能提高診斷的準確率。YU等[9]構建的EAC-ceRNA網絡中發現了包括AC007128.1等在內的12個lncRNAs與總生存期呈負相關，而AC004585.1等在內的14個lncRNAs與總生存期呈正相關。類似地，LIU等[10]發現WDFY3-AS2、AC007128.1等8個lncRNAs與患者預后相關。

豐富的生物信息學數據使ceRNA網絡的聯合應用范圍得以延伸，研究者可從更多角度篩選有預測價值的分子標志物。GUAN等[49]聯合ceRNA和DNA甲基化相關基因構建了食管癌分子標志物篩選模型，認為RNF217-AS1、HCP5、ZFPM2-AS1和HCG22是與ESCC患者預后相關的關鍵lncRNA。SHAO等[50]構建了ESCC組織的ceRNA網絡和轉錄因子調節網絡，發現了與新輔助放化療敏感度相關的5個關鍵miRNA(miR-520a等)、12個lincRNA(APCDD1L-AS1等)以及5個重要轉錄因子(BMP4等)

5 總結與展望

食管癌的惡性程度高、轉移進展快及預后差等特點都提示了開展有利于食管癌的早期診斷和干預相關研究的必要性。從影響腫瘤的發生發展過程的分子通路中尋找干預靶點是重要的研究方向。ceRNA理論揭示了RNA通過競爭結合miRNA實現相互作用并調控下游多種生物效應，進而影響腫瘤進程的新機制。近期眾多研究證實了多種RNA分子如lncRNA、circRNA等作為ceRNA調控食管癌的生長、侵襲等生物學過程，一方面顯示這些分子具有一定的預后提示意義，更重要的是提供了潛在的治療靶點。利用生物信息學方法構建ceRNA網絡篩選與食管癌預后相關的RNA分子標志物也具有極大的前景。但目前的研究仍存在一定不足，如腫瘤的發生發展涉及的RNA及作用通路眾多，當前研究仍處于起步階段，仍需要大量深入和補充；體外或動物模型的干預實驗所取得的成果需要長時間臨床轉化；ceRNA網絡的預測靶點還需要進一步驗證等。隨著未來研究的深入，ceRNA及其網絡的構建有望在食管癌的診斷和治療中發揮更重要的作用。