葡萄糖氧化酶的微生物發酵生產工藝研究

王佰濤， 楊文玲， 楊婧芳， 劉德海， 陳國參， 權淑靜，2

（1.河南省科學院生物研究所，河南鄭州450008；2.河南省工業酶工程技術研究中心，河南鄭州450008；3.安陽市動物衛生監督所，河南安陽455000）

葡萄糖氧化酶是分子質量為150 ～170 kDa的同源二聚體， 含有兩個緊密相連但非共價結合的黃素腺嘌呤二核苷酸輔助因子，能夠將β-D 葡萄糖氧化為葡萄糖醛酸和過氧化氫 （Wu 等，2018）。 近年來，葡萄糖氧化酶與人類生活聯系越來越緊密， 全球市場預測年增長率達到7.6%，市場價值將超過60 億美元（Rasul 等，2011）。 葡萄糖氧化酶廣泛應用于飼料業和食品業中， 可以改善動物飼料的消化利用率（Wang 等，2018）和食品的保鮮時間（Ge 等，2012）。 在生物電化學和臨床上葡萄糖氧化酶也有一些應用。例如，可以將其電化學特性用于生物燃料電池和生物傳感器方面的開發（Xu 等，2019）；利用其可加速癌細胞內的葡萄糖代謝， 促進癌細胞的壞死和凋亡 （Fan 等，2017）。葡萄糖氧化酶的這些應用促進了其市場需求， 其生產工藝和酶學性質的改進也成了實際研究中的重點， 要求其能夠在較高的溫度條件和較長的保存時間下仍然保持催化活性。

葡萄糖氧化酶在自然界中的來源范圍較廣，包括動物、植物和微生物，動植物來源的葡萄糖氧化酶種類較多，但產出效率較低。 例如，棉鈴蟲體內的葡萄糖-甲醇-膽堿氧化還原酶可以轉化為葡萄糖氧化酶，而后由下唇腺分泌出昆蟲體外，但分離過程復雜，應用價值較低（董人富等，2015）。微生物來源的葡萄糖氧化酶主要來自于真菌，并且產酶效率極高，其他來源的葡萄糖氧化酶，無論從產酶效率還是提取難易度都無法和微生物相比， 因此目前主要通過微生物發酵來生產葡萄糖氧化酶（王佰濤等，2019）。本文從葡萄糖氧化酶的發酵生產工藝、提取純化工藝、酶學特性改進工藝等方面對其做了簡單介紹。

1 葡萄糖氧化酶發酵生產工藝

葡萄糖氧化酶的微生物發酵生產工藝主要涉及到菌種選育、培養基優化、發酵條件優化等幾個方面，最終目的主要是通過選育優勢菌種、篩選最佳培養條件來提高產酶效率，降低生產成本，利于工業化生產和應用。

1.1 菌種選育 目前用于葡萄糖氧化酶生產的微生物主要是青霉和曲霉等絲狀真菌， 這些霉菌在底物親和力、 催化活性及熱穩定性方面各有優勢，不同生產條件下選用的菌種有所不同（Tu 等，2019）。 研究發現，霉菌在發酵過程中也存在某些不足，例如，霉菌菌絲體會增加發酵液黏度，進而影響發酵攪拌速率和供氧速率， 導致菌體營養不良，使得產品收率下降。酵母菌在液體深層發酵過程中能夠保持較高的生物量， 而且從培養液中分離程序簡單， 因此工業生產中也會選用酵母菌作為發酵菌種， 常常通過基因工程構建工程菌在酵母中進行異源表達，常用酵母菌有畢赤酵母、漢遜酵母、 酒 釀酵 母等 （Qiu 等，2016；Demain 等，2009）。最初篩選用于生產葡萄糖氧化酶的菌株應滿足以下條件：首先，應用菌株的產酶量較高且生產性能穩定；其次，從生產成本上考慮，應用菌株應易于培養， 且得到粗酶分離純化程序簡單；最后，應保證應用菌株產酶的安全性，避免對人體健康造成不必要的風險。 曲霉和青霉能夠作為生物產品在工業生產上取得成功， 很大程度上是由于這些菌株的代謝多功能性和其公認的安全性。 野生型菌株因發酵生產能力低下、 純化過程復雜而受到制約， 因此需要通過人工誘變進行特異性篩選，進而得到一些性能優越的菌株以利于生產。真菌DNA 在各種外界條件的作用下會發生嘧啶突變，產生遺傳變異。一般采取的誘變方法有伽馬射線照射、紫外照射、化學誘變、原生質體融合等。例如，Khattab 等（2005）在多個黑曲霉突變體種內進行原生質體融合以獲得高產葡萄糖氧化酶菌株，結果發現所有融合子活性均超出原菌株200%以上， 表現出比原菌株更高的葡萄糖氧化酶生產能力。 Haq 等（2014）利用乙基甲烷磺酸和亞硝酸對野生型菌株進行化學誘變以提高葡萄糖氧化酶產量， 獲得優勢菌株的產酶量達到野生菌株的3 倍以上。 說明通過菌種選育可以提高菌株產葡萄糖氧化酶的能力。

1.2 發酵條件優化 選育出優勢菌株以后，采用不同的發酵條件， 葡萄糖氧化酶發酵產出效率不同，因此需要對微生物發酵條件進行優化。 Singh等（2013）發現，利用黑曲霉生產葡萄糖氧化酶時，培養基中的Mg2+、Ag+、Cu2+等金屬離子會表現出明顯的抑制作用， 有必要對發酵培養基成分進行優化。固態發酵條件不易控制，葡萄糖氧化酶一般通過微生物液體發酵制得， 黑曲霉發酵培養基一般包括尿素、葡萄糖、KH2PO4、CaCO3等成分，青霉培養基一般包括蛋白胨、酵母膏、葡萄糖、KH2PO4、NH2NO3等成分（Rasul 等，2011）。發酵條件優化是在基礎培養成分的基礎上進行優化調整， 優化方法一般采取統計學方法，具體包括正交試驗方法、響應面方法、Plackett-Burman 方法等。 例如，Farid 等（2013）利用響應面法對黑曲霉NRC9 深層發酵產葡萄糖氧化酶進行優化， 在最佳培養條件下發酵酶活達到170 U/mL， 且準確率高達96.6%以上。 對發酵條件的優化不僅要考慮到產酶效率，也要考慮到生產成本，從發酵經濟學的角度來看， 發酵產品的產值主要是由產品的盈利能力和單位產品的生產成本驅動的， 二者綜合考慮達到最佳值才能利于工業生產。 例如，Rasul 等（2011）利用玉米漿替代葡萄糖用于黑曲霉葡萄糖氧化酶的生產，發現不僅生產成本有所降低，替換之后菌株產酶性能也明顯提高。

2 葡萄糖氧化酶提取純化工藝

根據葡萄糖氧化酶發酵生產工藝的不同，采取的提取純化工藝也不盡相同， 提取葡萄糖氧化酶需要通過細胞破碎將其從胞內或菌絲體釋放進入發酵液，細胞破碎常采取高壓勻漿、反復凍融、超聲破碎、液氮研磨或幾種方法聯合應用的方式，且不同菌種采用方法有所不同 （Tribst 等，2013；Bankar 等，2009）。 然后通過差速離心或過濾的方式將葡萄糖氧化酶從發酵液中提取分離出來，完成粗酶液的制備。 提取完成以后需要對葡萄糖氧化酶進一步純化， 目前用于葡萄糖氧化酶的純化方法較多，初步純化一般通過化學沉淀的方式，其中最常用的沉淀劑為硫酸銨（Simpson 等，2007）。化學沉淀劑的使用造成葡萄糖氧化酶中混有許多無機鹽離子，需要對其進一步去鹽純化，去鹽主要利用待分離產物的物化性質差異進行分離純化，如表面電荷、表面疏水性、分子量的差異或者對某些配體的生物專一性，常采用離子交換層析、凝膠過濾層析、透析等相結合的方式。離子交換層析是將離子交換基如二乙氨乙基結合到惰性載體上，常用的載體有纖維素、交聯葡聚糖等，然后根據酶蛋白所帶電荷的不同進行洗脫分離的一種方法，具體分為陽離子交換層析和陰離子交換層析（Zia等，2013）。 葡萄糖氧化酶的等電點一般為4 ～5，因此常采用陰離子交換層析（Dai 等，2002）。 并且研究發現， 過氧化氫酶作為葡萄糖氧化酶生產過程中的主要雜質，其等電點在6.5 左右，因此可以利用二者之間等電點的差異來輔助純化葡萄糖氧化酶， 以確保葡萄糖氧化酶不受過氧化氫酶的污染。凝膠過濾層析是根據分子大小不同進行分離，又稱作空間排斥層析，常用載體為葡聚糖凝膠，又稱作Sephadex 凝膠，根據葡萄糖氧化酶的大小常選用Sephadex G-200 凝膠層析 （Zia 等，2012）。此外， 葡萄糖氧化酶還可以采取液液萃取的方式進行分離純化， 利用反向膠束萃取技術將葡萄糖氧化酶從液體中萃取出來， 反向膠束在非極性液體中形成疏水性基團在外的球狀聚集體， 利用靜電作用力將葡萄糖氧化酶從水相提取到有機相之中，避免了葡萄糖氧化酶與有機相的直接接觸，為蛋白質在有機相中保存生物活性提供了良好的環境， 并且通過調整水相條件可以使葡萄糖氧化酶重新回到水相中，操作簡單（An 等，2012）。 例如，Ferreira 等（2005）通過利用反向膠束萃取技術純化葡萄糖氧化酶， 獲得葡萄糖氧化酶酶活超過250 U/mg， 過氧化氫酶活性控制在0.1 U/mg 以下。 經過提取純化之后的葡萄糖氧化酶最終經過冷凍干燥可制得成品。

3 葡萄糖氧化酶酶學特性改進工藝

葡萄糖氧化酶底物親和力較弱， 穩定性和催化活性較低，會阻礙其在工業上的應用，因此需要對其酶學特性加以改進以滿足工業應用的需求，目前常采用的方法有酶的固定化、化學修飾、基因工程改造等。

3.1 固定化 葡萄糖氧化酶的固定化是指將酶和不同的載體結合用以改善酶學特性， 通過葡萄糖氧化酶固定化技術可以提高其酸堿穩定性和熱穩定性， 并且能夠實現酶的反復使用， 增加利用率。 目前葡萄糖氧化酶的固定化研究主要集中在生物燃料電池或生物傳感器的電極修飾方面，通過固定化技術將化學信號轉為有效的電信號，通過物理吸附、化學交聯、共價結合、微膠囊化等方法將葡萄糖氧化酶固定到不同的載體上， 然后將其修飾到不同電極上制成各類傳感器。例如，Shan等（2009）通過將端羧基離子液體與聚乙烯亞胺通過共價鍵連接制備聚乙烯亞胺功能化離子液體，然后利用聚乙烯亞胺功能化離子液體固定葡萄糖氧化酶，將其用于制備電化學葡萄糖傳感器。目前可用于葡萄糖氧化酶固定的載體種類較多， 其中納米材料因其本身巨大的比表面積和多孔性而受到廣泛關注。例如，熊志剛等（2010）將葡萄糖氧化酶固定到四氧化三鐵納米粒子上， 然后將這種復合納米材料修飾到電極上制成葡萄糖傳感器，納米材料能夠很好地保護葡萄糖氧化酶的生物活性，進而氧化葡萄糖生成過氧化氫，激發相應的電信號，且獲得的電信號強度與葡萄糖濃度成正比，可以將其用于血液葡萄糖濃度監測。 目前隨著固定化技術的發展， 雖然對葡萄糖氧化酶固定化處理后酶學特性會有所提高， 但固定化后的擴散約束和酶活性降低等問題限制了這種技術的廣泛應用，因此需要進一步改進以獲得更大效益。

3.2 化學修飾 葡萄糖氧化酶的化學修飾是從化學結構層面對其進行結構改造， 從而使得葡萄糖氧化酶的某些特性得以改善。 Xu 等（2017）發現， 通過有機酸酯聚合物原位聚合修飾葡萄糖氧化酶能夠提高葡萄糖氧化酶的活性， 首先對丙烯酸、丙烯酸甲酯、丙烯酸叔丁酯及乙二醇丙烯酸酯四種不同的單體進行原位聚合， 然后分別與葡萄糖氧化酶聚合生成聚合產物， 通過測定不同葡萄糖氧化酶聚合產物和游離葡萄糖氧化酶的生物活性和穩定性發現， 所有聚合產物的活性和穩定性均明顯提高， 且親水性聚合產物活性比疏水性聚合產物更高， 疏水性聚合產物比親水性聚合產物具有更好的穩定性。此外，多糖與葡萄糖氧化酶形成糖苷也能提高酶的穩定性。 例如，Matos 等（2012）用交聯羧甲基纖維素-β-環糊精對葡萄糖氧化酶進行化學修飾發現， 雖然得到的糖基化葡萄糖氧化酶的凈含量有所下降， 但仍然保持了67%的初始酶活力，并且相比游離葡萄糖氧化酶，糖基化之后酶的Km 值較高， 熱穩定性更好。 因此， 通過對葡萄糖氧化酶的化學修飾可以達到改善其酶學特性的目的。

3.3 基因工程和蛋白質工程 雖然葡萄糖氧化酶在天然狀態下的表達量不高，抗氧化能力不強，但基因工程和蛋白質工程技術可以提高大規模生產葡萄糖氧化酶的能力。 Qiu 等（2016）為了獲得高表達葡萄糖氧化酶菌株， 將黑曲霉葡萄糖氧化酶基因插入到帶有pGAP 啟動子的pGAPZαA 質粒中， 然后導入畢赤酵母中表達，30 ℃測定培養基上清液葡萄糖氧化酶酶活達到107.18 U/mL，重組酶活性比原菌株表達的酶活性高1.35 倍。Jiang 等（2015）研究葡萄糖氧化酶活性受到過氧化氫抑制的機制發現， 蛋氨酸可以被過氧化氫氧化生產成蛋氨酸亞砜，從而使葡萄糖氧化酶失活。為了防止葡萄糖氧化酶氧化， 設計用其他氨基酸取代蛋氨酸， 通過計算機輔助同源建模和CDOCKER 算法進行計算機輔助設計分析， 確定葡萄糖氧化酶突變體， 結果發現取代蛋氨酸之后的葡萄糖氧化酶抗氧化活性明顯提高。 Tu 等（2019）為了提高葡萄糖氧化酶的熱穩定性和催化活性，對產葡萄糖氧化酶黑曲霉進行誘變，結果發現最活躍的菌株M4 有6 個氨基酸發生了替換，最大酶活損失一半的溫度明顯提高，60 ℃的酶熱失活半衰期提高至原來的8 倍左右。

4 葡萄糖氧化酶質量控制工藝

葡萄糖氧化酶質量控制主要考察酶活力、酸堿穩定性、耐熱穩定性、儲存穩定性等指標。 葡萄糖氧化酶對β-D-葡萄糖具有很高的專一性，β-D-葡萄糖在C-1 位被氧化生成δ-葡萄糖酸-1,5-內酯，然后自發水解為葡萄糖醛酸。葡萄糖氧化酶酶活定義是每分鐘將1 μmol/L 的β-D-葡萄糖氧化為葡萄糖醛酸和過氧化氫所需的酶量作為一個酶活單位（U/mL）（劉春瑩等，2019）。 目前在酶活力方面，葡萄糖氧化酶還沒有相應的國家標準，一般應用于飼料和食品的酶活力應控制在50 U/mL以上。 常用的葡萄糖氧化酶測定方法有鄰聯茴香胺法、4-氨基安替吡啉法等（朱運平等，2019）。 一般情況下，葡萄糖氧化酶在37 ℃保持高酶活應大于30 min，冷凍干燥處理后的葡萄糖氧化酶制劑在-20 ℃下應保持穩定最少達6 個月， 固定化處理之后應用效果更好，加入木糖醇、山梨醇等多元醇對其有穩定作用（Ye 等，1988）。 達到酶活標準和穩定性標準的葡萄糖氧化酶在飼料和食品中應用時需要對其安全性和衛生性進行進一步評價，包括鉛、砷等重金屬離子含量、黃曲霉毒素B1 含量、致病菌個數等。 Konishi 等（2013）對產黃青霉提取的葡萄糖氧化酶制劑在商業用途中的安全性進行測定， 驗證了葡萄糖氧化酶在飼料和食品中應用的安全性。

5 展望與挑戰

目前葡萄糖氧化酶在飼料業和食品業市場潛力巨大， 成為許多生物專家和企業家的重點關注對象。 雖然多種微生物都可以生產葡萄糖氧化酶，仍然需要對發酵生產工藝不斷優化，進一步控制發酵成本，改善其酶學特性，適應不同的市場需求，以便更加商業化地生產和利用葡萄糖氧化酶義。