循環腫瘤細胞在胰腺癌診治中的研究進展

王鑫，黃靜，劉燁磊，陸才德

作者單位： 315000 寧波，寧波大學醫學院（王鑫、劉燁磊）；寧波市醫療中心李惠利醫院（黃靜、陸才德）

胰腺惡性腫瘤主要為胰腺導管腺癌（PDAC），而大多數PDAC 確診時已經為晚期。PDAC 的侵襲性極強，且對靶向治療和細胞毒性治療的反應較差。現階段PDAC缺乏典型的早期臨床癥狀及較敏感的生物標記物，且早期胰腺腫瘤的穿刺活檢較困難，早期難以發現[1]。盡管近期超聲內鏡下活檢已取得一定的進展，有利于PDAC的診斷，但穿刺活檢假陰性率較高[2]。循環腫瘤細胞（CTCs）被認為是多類實體腫瘤另外一種轉移方式，包括肝癌、胰腺癌等，即使在外科手術切除后外周血中仍能檢測到CTCs，利用CTCs 檢測早期胰腺腫瘤，具有安全性高、耐受低及敏感性高等優點，可用于胰腺疾病的早期檢測、預后、治療方案選擇和疾病預后監測等方面。本文就CTCs在胰腺癌診治中的進展作一綜述。

1 CTCs 概述

CTCs 最早在19 世紀的時候提出，腫瘤細胞可以被動從實體腫瘤上脫落[3]，或者通過上皮間充質轉變（EMT）而發生主動轉移。在外周血中只有極少量的CTCs，這對于檢測和分離CTCs造成了極大的困難，隨著腫瘤轉移機制研究的深入和檢測技術的進步，目前研究人員能夠使用液體組織活檢技術從一個簡單的血液樣本中尋找到CTCs。由于CTCs 源自于原發實體腫瘤[4]，因此CTCs 可以提供一個非侵入性的方法來診斷和評估胰腺癌的類型以及腫瘤現處于的階段，而對CTCs的重復收集和分析也可以用于檢測疾病的進展以及患者對治療的實時反映。

2 CTCs 的分離

從血液成分中分離CTCs的技術，大多數可以被歸類為基于其生物屬性或其物理屬性（包括其細胞大小、密度），一旦CTCs被分離，它們能夠通過免疫細胞化學、免疫熒光、顯微鏡分析生物標記等方式被確定，現階段主要分離的方法有細胞過濾技術（ISET）、密度梯度離心法（DGC）、熒光激活細胞分選（FACS）、免疫磁珠分選法（MACS）等方式[5]。

2.1 物理方式 CTCs較正常細胞相比具有更低的浮力密度及更大的體積[6]。基于密度的分離方法常常基于Onco Quick 試劑盒，通常情況下血液樣本會被稀釋，并在介質上分層，最后使用離心機進行分離。除了密度梯度分離之外，OncoQuick合并了多孔膜，能減少與CTCs相似密度的血細胞的數量[7]。而ISET 則使用聚碳酸酯薄膜過濾器，用8 m 大小的圓柱孔來獲取血液樣本中的CTCs[8]。目前也有部分研究人員使用雙向電泳分離腫瘤細胞，利用腫瘤細胞的介電性能來分離出可行的CTCs，這種特性在不同細胞中類型不同，可用來分離腫瘤細胞以用于培養和分析。

2.2 生物性質分離 大多數以免疫為基礎的CTCs 濃縮方法，都利用上皮細胞表面生物標志物的表達來識別CTCs，其中最常使用的是上皮細胞粘附分子（EpCAM）。在分離過程中，磁性微珠表面會被涂上EpCAM 抗體，之后通過一個特定磁場來吸引已經結合CTCs 的磁性微珠，從而可以達到分離CTCs 的目的。MACS 可分為正性分離和負性分離，正性分離指從樣品血液中分離得到腫瘤細胞，負性分離指從血液樣本中去除其他無關血細胞而得到腫瘤細胞。現階段微流體設備也用于CTCs 富集，其表面帶有EpCAM 抗體涂層用于結合CTCs，具有微型化、成本低及特異性高等特點。現今將CTCs 吸引到導絲的概念已經應用于體內，Saucedo-Zeni等[9]設計了一種EpCAM 功能化的醫用Seldinger 導絲，將其插入患者的靜脈血管中，以捕捉和富集CTCs，這設備將來可能用于直接從PDAC 患者體內檢測CTCs。CellSearch 系統是唯一一種美國食品和藥物監督管理局批準的CTCs 檢測系統，該系統采用以EpCAM為基礎的免疫磁珠富集法從而用于檢測CTCs，之后根據CD45 陰性，CK8、CK18 和CK19為陽性來分離獲得CTCs[10]。然而CTCs檢測目前仍未發現特異性靶點，各種方法檢出率也不盡相同，如上述EpCAM靶點，僅為上皮細胞標志，而非胰腺癌腫瘤細胞特異性靶點。

3 CTCs 在胰腺癌治療中的應用前景

3.1 檢測和診斷 CTCs可用于胰腺癌的早期檢測及診斷，He 等[11]分別檢測了CTCs、循環腫瘤DNA（CT-DNA）以及組織活檢中EGFR 突變的情況，得到了高達95%的一致率。當前影像學作為腫瘤的常規檢測手段，臨床醫生很難發現較小的實體腫瘤，通過國內外研究可以看到，很多腫瘤在2 ～4 mm 的情況下已經有腫瘤細胞進入血液循環，甚至在遠處形成新的病灶。其他癌前病變（如IPMN）或良性病變（如慢性胰腺炎）必須通過影像學和超聲內鏡下活檢與癌癥相鑒別。在Rhim 等[12]的一項研究中，33%的IPMN 患者中發現循環內皮細胞（CECs），但未發現CTCs，而在PDAC患者中，73%的病例中CTCs 呈現陽性。因此CTCs 能夠為胰腺腫瘤的定性提供一定的參考價值，從而避免穿刺活檢給患者帶來的傷害。

研究報告了從門靜脈與外周血分離的CTCs 的潛在差異。在一項對20 例胰腺癌患者的研究中，Bissolati 等[13]發現，在隨訪3 年的患者中，從門靜脈中可檢出的CTCs 的患者較CTCs 陰性患者具有更高的轉移率。在另一項類似的研究中，Catenacci 等[14]對18 例PDAC 患者進行研究，在超聲內鏡下獲取受試患者門靜脈血液樣本，CTCs 陽性率為100%，而在外周血循環中只有4 例患者發現CTCs，提示門靜脈血相較于外周血CTCs 檢測率明顯升高。國內研究人員通過超聲內鏡下穿刺PDAC患者門靜脈獲取血液標本，提示CTCs 檢出率為100%[15]。在超聲內鏡進一步推廣后，通過門靜脈檢測CTCs 技術的安全性及實用性將大為提高。

3.2 預后和監控 在對胰腺癌CTCs 研究的廣泛文獻檢索中發現，CTCs陽性患者普遍具有較差的無瘤生存期及總存活率。Han 等[16]評估了共623 例PDAC 患者，在268 例患者的血液樣本中檢測到CTCs（43%）；這些患者的無進展生存期和整體存活率較CTCs檢測陰性的患者要短得多。

晚期PDAC患者的化療后評估常常通過影像學完成，然而研究發現通過化療后CTCs檢測可評估化療效果，從而指導臨床化療選擇。在實驗研究中，Bidard等[17]評估了29 例晚期PDAC 患者的CTCs陽性率和存活率之間的相關性，這些患者行化療治療2 個月后行CTCs 檢測，提示CTCs陽性的患者多為低分化腫瘤，且總體存活時間較短。Okubo 等[18]評估了65 例胰腺癌患者，在21 例患者中血液樣本中找到CTCs，并且全部CTCs陽性患者皆為晚期胰腺癌，此項研究也表明當進行化療3 個月后，CTCs檢測仍為陽性的患者總生存率低于CTCs 轉陰患者。另一些研究對CTCs 的評估與患者的腫瘤發展聯系提供了更細致的見解。Gemenetzis 等[19]通過實驗指出，當影像學能夠提示腫瘤復發前的2 個月，研究人員就能發現患者體內CTCs 出現明顯的增高；一項薈萃分析納入19項研究，1 320 例確診個體，經過Meta 分析顯示CTCs 陽性患者的總生存期（P ＜0.001）和無進展生存期明顯縮短（P=0.003），此外，按種族劃分的亞組分析表明，CTCs陽性患者在亞洲和西方人群中的總生存期都明顯縮短，并無人群差異[20]。

外周血中癌細胞不是均一的種群，而是由不同種類的細胞構成，某些亞種群在腫瘤進展和轉移中起著主要作用。且現有文章表明發生EMT的CTCs處于“冬眠”，大部分無法增值形成轉移灶，遂需要尋求新的特異性標志物以鑒別最終形成轉移灶的CTCs[21]。Sun 等[22]對46 例行手術切除的PDAC 患者進行研究，將捕獲的CTCs 分化為上皮型（E-CTCs）、間葉型（M-CTCs）和雜交型（H-CTCs）三種表型，結果提示H-CTCs在PDAC轉移中具有良好的預測作用，而E-CTCs 在PDAC 患者OS 方面起到良好的預測作用，E-CTCs＜11.0CTCS/2ml患者中位OS為16.5 個月，E-CTCs＞11.0CTCS/2ml 患者中位OS 為5.5 個月（P=0.016）。對CTCs進行分型能夠使CTCs在胰腺癌預后方面起到更好的預測作用。

3.3 單細胞測序 在檢測到實體腫瘤之前，已經可從患者身上分離出CTCs，且腫瘤的發生與發展和細胞基因的突變密切相關[23]。因此，對CTCs 中致癌基因和抑癌基因的突變分析，以及對單細胞畸變染色，可以用來證實CTCs 的腫瘤來源從而達到診斷目的[24-25]。從胰腺癌的基因組分析中可以了解到，根據不同的分子亞型可對PDAC 進行分類，從而能夠揭示出潛在的治療靶點[26]。WNT基因在PDAC細胞中的表達抑制了腫瘤凋亡，并增加腫瘤轉移傾向，Yu 等[27]對11 例PDCA 大鼠進行CTCs 中RNA 測序，有5 例CTCs 顯示WNT 信號富集，因此對于CTCs 的單細胞測序能夠提供腫瘤潛在的治療靶點。基因測序的改進使研究人員能夠對CTCs 樣本進行基因組分析，明確與患者預后和治療反應相關的基因改變，從而幫助指導患者治療方案的制定。Ting 等[28]比較了從胰腺癌小鼠身上分離出的CTCs 和相應的原發性腫瘤的全基因組表達譜，其中單細胞DNA 測序顯示，與原發腫瘤細胞相比，CTCs 表達了大量基質衍生的細胞外基質蛋白，發現它們增加了腫瘤細胞的侵入性和遷移性，從而促進腫瘤的轉移。現階段全基因測序存在潛在的非法轉錄和放大偏誤，這將成為單細胞分析的一個巨大挑戰。

3.4 體外預測模擬 隨著更多的細胞毒性和生物治療藥物的出現，為了遠離傳統經驗療法，現階段需要開發能夠預測患者對藥物反應的試驗。CTCs 可以在體外培養，可以通過CTCs 對不同藥物的敏感性，從而選擇最佳的治療方案，實現個性化治療。且利用CTCs 比原發性實體腫瘤細胞更加有利，CTCs存在著負責轉移的起始和將腫瘤傳播其他部位的能力，而干預轉移是提高療效的關鍵。現今體外CTCs 培養雖仍處在挑戰，大多數方案在樣本前處理、富級分選過程和培養條件不當都會導致對CTCs 不可逆的損傷，且由于長期培養和多次傳代可能致使CTCs 在基因表達和表觀遺傳學方面不再代表原始腫瘤的表型。CTCs細胞株培養的效率現有所提高，提高效率的方法包括使用非附著的三維培養條件、基質支撐層或低氧條件來增加CTCs 的生存。盡管存在挑戰，但這一領域的進展可以改善患者的診斷和管理。現階段CTCs 能夠被長期體外培養，且肺癌或乳腺癌患者的CTCs 已經被成功地在體外培養用于檢測治療藥物療效[29-30]，但對于胰腺癌患者CTCs 仍缺少足夠的實驗來支持它的臨床應用。

4 結論

胰腺癌在目前來說是一種高度侵襲性的疾病，在過去的許多年里，患者的預后改善不明顯。持續發展更為敏感、高通量和高效的CTCs 檢測方式，能夠加強CTCs 在臨床中的應用。對CTCs 的深入研究可以增加對胰腺癌的形成、進展、轉移和腫瘤內異質性的更深一步的認識，并能夠使個性化醫療的體外藥物測試平臺得到進一步的發展。對于高風險的疑似患者，可能在未來常規體檢時能夠接受CTCs 的篩選，從而增加對胰腺癌的早期檢測。雖然胰腺癌中找尋CTCs的研究為胰腺癌轉移、診斷和治療提供新的思路，但在當前情況下仍有大量未探索的問題等待深入研究，比如如何高效的收集CTCs，進一步的找尋CTCs 的細胞生物學特性和特異分子標志物等。