藏藥四味辣根菜湯散對大鼠心肌缺血再灌注損傷炎癥因子的影響*

保善錄，李永芳，段雅彬，吉先才讓 ，曹志東，王津慧 △

1 青海省人民醫(yī)院中西醫(yī)結(jié)合科，青海 西寧 810001; 2青海大學; 3 青海省藏醫(yī)院

藏藥四味辣根菜湯散系傳統(tǒng)藏成藥，藏藥名為索洛西湯，由高山辣根菜、紫草茸、狹葉紅景天及甘草組成。《四部醫(yī)典》記載其具有滋陰清熱和涼血止血的功效，主要用于治療發(fā)燒、氣短、目赤、唇舌及腮頰紫紺、喉堵聲不揚、上體腔脹滿、呼吸喘急、咯吐血痰為主的胸腔內(nèi)惡血泛溢及心肺腫脹等癥［1-4］。青藏高原地區(qū)的人們由于地理環(huán)境、民俗民風和膳食與平原地區(qū)不同，導致該地區(qū)心肌缺血疾病較平原地區(qū)多發(fā)。目前治療手段主要有冠脈內(nèi)溶栓術，冠脈內(nèi)球囊擴張血管成形術及體外循環(huán)心內(nèi)直視手術等。因缺血組織適應性代償，冠狀動脈經(jīng)外科手術再通后易造成再灌注損傷，會對組織造成缺血和再灌注雙重損傷。因此，尋找有效防治心肌缺血再灌注損傷、減少缺血發(fā)作、縮短冠脈再通時間、提高缺血再灌注心肌能量代謝的藥物迫在眉睫。本研究應用現(xiàn)代藥理動物實驗方法，為藏藥四味辣根菜湯散的臨床應用提供依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 動物與分組48 只 8 周齡 SPF 級 Wistar 雄性大鼠，體質(zhì)量（240±20）g，由蘭州大學實驗動物中心提供，實驗動物合格證號：SCXK（甘）2013-0002；每籠8 只飼養(yǎng)于青海大學醫(yī)學院實驗動物中心；每日給足水和大鼠維持飼料；室溫（20±2）℃，光照明暗12 h 交替；適應性喂養(yǎng)3 天。隨機分為6 組：假手術組、模型組、陽性丹參組及四味辣根菜湯散低、中、高劑量組。

1.2 藥物提取與給藥將四味辣根菜湯散（青海省藏醫(yī)院制劑科，散劑，批號：20130607）加水浸泡2 h，煎煮至沸騰后再煎30 min，過濾，加水重復上述過程2 次，合并2 次濾液，濃縮至50%濃度；丹參（毫州市遠光中藥飲片廠，散劑，批號：20140701）水提液制備方法同四味辣根菜湯散；完成后4℃避光保存?zhèn)溆谩Ｋ奈独备藴⒊扇藙┝繛槊咳? g/60 kg［即 0.2 g/（kg·d）］。低、中、高劑量等于成人劑量的5、10、15倍［即0.7、1.4、2.1 g/（kg·d）］，丹參粉成人每日 15 g/60 kg［即 0.25 g/（kg·d）］，大鼠灌胃量等于成人的7 倍［即1.75 g/（kg·d）］。假手術組和模型組灌胃等容積生理鹽水，劑量為1.4 g/（kg·d）。每只大鼠每日灌胃1 次，連續(xù) 10天。

1.3 儀器BL-420S 型生物機能實驗系統(tǒng)（成都泰盟公司）；HX-300S 型動物呼吸機（成都泰盟）；DNW-960型酶標分析儀（北京普朗有限公司）；UV-2550型紫外分光光度計（日本島津公司）；H-600IV 型透射電子顯微鏡（日本Hitach 公司）；自制三叉玻璃氣管插管和0.8 mm透明軟聚丙烯塑料管。

1.4 試劑白細胞介素1β(interleukin-1β，IL-1β；批號：E-30418）、白細胞介素6(interleukin-6，IL-6；批號：E-30644）、腫瘤壞死因子α(tumor necrosis factorα，TNF-α；批號：E-30633）、肌紅蛋白（myoglobin，Mb；批號 ：E-30419）、超敏C 反應蛋白(high-sensitivity C-reactive protein，hs-CRP；批號：E-3025）試劑盒均購自英國Abcam公司（分裝型）。

1.5 模型制備1）大鼠術前禁食6 h，20%烏拉坦5 mL/kg對大鼠實施腹腔注射麻醉。仰臥位固定，用電腦及BL-420S 生物機能實驗信號采集系統(tǒng)連接心電圖，記錄Ⅱ?qū)?lián)心電圖［4-7］。2）分離出氣管，眼科剪倒T 剪開氣管，自制三叉玻璃氣管插管連接小動物呼吸機，調(diào)整呼吸機潮氣量和頻率與大鼠呼吸動作一致。3）碘伏胸腹部消毒，胸骨左緣0.5 cm 處剪開胸部皮膚，于2～4 肋間剪斷第3和第4 肋，鈍性分離肋間肌和胸膜，暴露心臟于視野，眼科鑷撕開心包膜。穿5-0 號規(guī)格非吸收性縫合線從底部經(jīng)過左冠狀動脈左前降支，在左心耳與肺動脈圓錐交界處往下約1～2 cm處進針，深1.0～1.5 mm，寬2～3 mm。適應穩(wěn)定心率5 min，將一根直徑約0.8 mm，長約1.5 cm 的透明軟聚丙烯塑料管置于結(jié)扎線與冠狀動脈之間。貼緊并結(jié)扎縫合線，使透明軟聚丙烯塑料管壓迫冠狀動脈造成冠脈閉塞，制作急性心肌缺血模型。4）肉眼觀察結(jié)扎部位以下心肌表面顏色由鮮紅變暗紅，心電圖QRS波群增高、增寬、ST段抬高為結(jié)扎成功表現(xiàn)［7］。5）缺血30 min 后用眼科剪剪斷透明軟聚丙烯塑料管及結(jié)扎線，形成再灌注狀態(tài)，以心臟表面顏色轉(zhuǎn)為鮮紅和抬高的ST段下降在1/2以上為再灌注成功標志［8］，再灌注 90 min。6）假手術組大鼠只穿線不結(jié)扎左冠狀動脈。

1.6 檢測指標再灌注結(jié)束腹主動脈取血5 mL以上，離心半徑 15 cm，4000 r/min 離心10 min，取上清液-80℃冰箱冷藏備用。用酶聯(lián)免疫吸附法測定炎癥因子水平。

1.7 統(tǒng)計學方法運用SPSS 20.0 軟件分析數(shù)據(jù)，計量資料以（）表示，多組比較采用單因素方差分析，組間兩兩比較采用LSD-t法，檢驗水準為α=0.05。

2 結(jié)果

與假手術組比較，模型組大鼠血清IL-1β、IL-6、Mb、hs-CRP及TNF-α含量升高（P＜0.01）；與模型組比較，四味辣根菜湯散低、中、高劑量均能減少血清 IL-1β、IL-6、Mb、hs-CRP 及TNF-α含量（P＜0.05）；與陽性丹參組比較，四味辣根菜湯散低劑量組血清IL-1β、IL-6、Mb含量升高（P＜0.01），中、高劑量組hs-CRP 及高劑量組TNF-α降低（P＜0.01）。見表1。

表1 各組大鼠血清IL-1β、IL-6及Mb、hs-CRP與TNF-α含量（） ng/L

注：*表示與模型組比較，P＜0.01；#表示與陽性丹參組比較，P＜0.01

組別假手術組模型組陽性丹參組四味辣根菜湯散低劑量組四味辣根菜湯散中劑量組四味辣根菜湯散高劑量組TNF-α（ng/L）30.63±0.73*59.27±0.61 46.04±0.38*49.79±0.45*44.93±0.30*37.78±0.47*#鼠數(shù)8 8 8 8 8 8 IL-1β 2.77±0.11*8.89±0.20 3.58±0.08*4.63±0.11*#3.53±0.06*#3.26±0.04*#IL-6 16.43±0.09*26.14±0.15 14.05±0.13*18.38±0.19*#12.52±0.06*10.46±0.08*#Mb（ng/L）250.98±5.03*718.79±7.15 408.15±8.49*558.28±6.97*#355.34±7.22*#324.80±6.25*#hs-CRP（μg/L）0.60±0.01*3.09±0.03 1.29±0.06*1.75±0.09*0.93±0.01*#0.82±0.05*#

3 討論

心肌缺血再灌注損傷的原因較為復雜，目前國內(nèi)外公認與再灌注后細胞內(nèi)Ca2+超載、氧自由基大量生成、微血管內(nèi)皮細胞損傷及血管內(nèi)皮細胞與白細胞/血小板之間的相互作用關系密切。IL-1β在炎癥級聯(lián)的上段，心肌缺血初期血清中有IL-1β表達［9］。本研究結(jié)果顯示，心肌缺血再灌注模型組血清IL-1β含量高于假手術組，四味辣根菜湯散各藥物組中IL-1β表達低于模型組，表明四味辣根菜湯散阻礙cAMP升高，抑制IL-1β釋放，減輕心肌缺血再灌注損傷引起的炎癥反應。血清IL-6 水平的變化與左冠狀動脈阻塞引起的心肌梗死范圍關聯(lián)較大，更是后續(xù)嚴重并發(fā)癥的預測因子［9］。本研究模型組中IL-6 含量較高，說明心肌缺血梗死后IL-6 信號轉(zhuǎn)導受體成分“糖蛋白130”導致心肌細胞釋放IL-6增多。四味辣根菜湯散各劑量組血清IL-6 含量較模型組低，表明在心肌缺血再灌注損傷時四味辣根菜湯散通過降低細胞內(nèi)cAMP 濃度或腺苷和阿片受體延遲途徑，抑制心肌細胞對IL-6的合成和釋放。

急性心肌缺血再灌注損傷時，心肌中Mb 最先被釋放入血液中，1～4 h 血液中Mb 超出正常上限，因此測定血清Mb 可作為急性心肌梗死診斷的早期項目［10］。模型組Mb 濃度高于假手術組，四味辣根菜湯散各劑量組Mb 含量降低，說明四味辣根菜湯散能抑制心肌缺血再灌注損傷Mb 釋放入血，降低心肌耗氧量，減少炎癥反應，從而保護心肌細胞。hs-CRP 是全身性炎癥反應急性期的非特異性標志物之一，在心血管危險事件中具有較強的預測性。模型組hs-CRP 含量高于假手術組，四味辣根菜湯散各劑量組hs-CRP 含量低于模型組，說明四味辣根菜湯散能有效抑制由心肌缺血再灌注損傷引起的炎癥反應，保護心肌和心肌細胞。TNF-α參與組織損傷引起的炎癥反應和免疫反應［11-12］。心肌缺血再灌注模型組大鼠血清中TNF-α含量高于假手術組，四味辣根菜湯散各劑量組大鼠血清TNF-α含量低于模型組，說明四味辣根菜湯散能降低心肌成纖維細胞分泌TNF-α。

可見，四味辣根菜湯散能夠干預Akt/NF-κB信號途徑的激活，抑制心肌成纖維細胞釋放IL-1β、IL-6、Mb、hs-CRP 及 TNF-α等炎癥因子，減輕心肌缺血再灌注過程中的旁分泌炎癥因子釋放，對心肌缺血再灌注損傷具有間接保護作用。