多不飽和脂肪酸代謝產物氧脂對氧化應激的調節作用

弓 劍 ， 曉 敏

（內蒙古師范大學生命科學與技術學院，內蒙古呼和浩特010022）

氧化應激是由于促氧化劑的生成和抗氧化系統之間的不平衡導致的。 環境應激（熱、冷）、管理應激（分群、運輸）、營養應激（營養物質缺乏或不平衡）、代謝應激（妊娠、泌乳）以及免疫應激（反應過度）等諸多因素均可導致氧化應激。其結果是引起蛋白質、脂質和DNA 等生物大分子的氧化損傷或破壞，最終影響動物的生產性能、生殖機能、免疫功能、 動物產品品質以及動物健康。 在氧化應激對動物的不利影響中， 對免疫功能尤其是炎癥的影響一直是人們關注的熱點。 氧化應激可通過激活核因子κB（NF-κB）等信號通路誘導炎癥，而炎癥反過來又可誘導氧化應激， 如果氧化應激不能被及時解除， 將會形成一種氧化應激與炎癥之間的惡性循環， 其結果是導致不可控或功能異常的炎癥反應， 表現為低程度持續存在的慢性炎癥（Sordillo 和 Raphael，2013）。 研究表明，氧化應激誘導的炎癥（尤其是慢性炎癥）是包括動脈硬化、糖尿病、肥胖、乳房炎等許多疾病發生的病理原因（Mattmiller 等，2013）。 因此，了解氧化應激的發生機制及調節因素， 并針對性地通過營養干預策略阻止或減緩氧化應激的發生， 對于優化機體的免疫功能進而預防疾病的發生具有重要的意義。 多不飽和脂肪酸（PUFA）經氧合代謝可生成多種脂質代謝產物，統稱為氧化脂質，簡稱氧脂。 氧脂對炎癥的啟動、發展和消退具有重要的調節作用，例如，前列腺素 E2（PGE2）和白三烯 B4（LTB4）具有很強的促炎作用，而 PGD2和脂氧素 A4（LXA4）具有抗炎或促進炎癥消退的作用。 近年來越來越多的研究證據表明， 氧脂也具有調節細胞內氧化還原狀態的作用，其中，一些氧脂能促進氧化劑的生成或本身就是活性很強的氧化劑， 而有的氧脂具有抑制促氧化劑生成或促進抗氧化劑生成的作用（Mavangira 和 Sordillo，2018）。可見，氧脂的生成模式不僅影響著炎癥的發展方向， 而且也影響著細胞的氧化還原狀態， 提示其在調節氧化應激和炎癥反應的平衡方面起著關鍵的樞紐作用。 關于氧脂對炎癥的調節已有許多文獻報道， 作者在以前的文章中也曾詳細闡述了氧脂對炎癥反應的調節作用 （弓劍和曉敏，2017）。 因此， 本文主要闡述PUFA 代謝產物氧脂對氧化應激的調節及其機制。

1 氧化應激概述

幾乎所有的需氧生物在生命活動過程中都會產生活性氧 （ROS），ROS 是一類含有一個或多個未配對電子的小分子物質， 包括自由基和非自由基兩種形式。氧自由基由于具有未配對的電子，因而極不穩定， 始終試圖從其他化合物得到電子而得以完全還原，因而是一類活性很高的氧化劑。此外， 在一氧化氮合酶的催化下，L-精氨酸可以和氧發生反應生成一氧化氮（NO），而NO 和超氧陰離子反應可生成過氧亞硝基陰離子 （ONOO-），盡管這些被稱為活性氮 （RNS） 的活性物質不屬于ROS，但也具有很強的促氧化作用。

ROS 和RNS 對機體組織和細胞的功能具有雙重影響，生理濃度下可作為信號分子介導增殖、分化和代謝適應等細胞活動過程。 盡管在先天免疫系統中，ROS 和RNS 的生成是先天免疫細胞殺傷入侵病原微生物的一種重要機制， 但這些物質的過量生成不僅不利于正常的細胞活動， 而且也不利于吞噬細胞對病原微生物的殺傷。因此，機體進化出強大的抗氧化系統用以處理ROS 以及RNS 等促氧化劑。 抗氧化系統主要由內源性的抗氧化酶和抗氧化劑以及日糧來源的抗氧化劑組成，酶和非酶抗氧化劑協同作用，保護細胞免受自由基誘導的細胞和組織損傷。歸納而言，抗氧化系統主要從三個水平實現對自由基的清除。 第一個水平是通過清除自由基生成的前體或滅活催化自由基生成的催化劑來阻止自由基的生成， 主要由超氧化物歧化酶 （SOD）、 谷胱甘肽過氧化物酶（GSH-Px）、過氧化氫酶（CAT）和金屬硫蛋白完成；第二個水平是中斷氧化鏈式反應，主要由維生素E、輔酶Q、類胡蘿卜素、維生素A、抗壞血酸和尿酸完成； 第三個水平是修復和清除損傷和破壞的生物大分子，主要由脂解酶、蛋白水解酶、DNA修復酶、連接酶和聚合酶等完成。 然而，在一些特定的條件下（細胞代謝活動增強、炎癥、疾病），促氧化劑的生成明顯增強， 同時可能伴有抗氧化功能的降低， 當促氧化劑的生成超過抗氧化系統的處理能力時就會導致氧化應激（Valko 等，2007）。

2 氧脂對氧化應激的調節作用

PUFA 是一類脂肪酸碳鏈上含有2 個或2 個以上雙鍵且碳原子數為18 ～22 的直鏈脂肪酸。ω-6（n-6）PUFA 包括十八碳二烯酸（LA）和二十碳四烯酸（ARA），ω-3（n-3）PUFA 包括十八碳三烯酸（ALA）、二十碳五烯酸（EPA）、二十二碳六烯酸（DHA）和二十二碳五烯酸（DPA）。由磷脂酶A2（PLA2） 催化從細胞膜脂質釋放出來的PUFA 經相關酶途徑代謝生成多種氧脂。 此外， 膜脂質中處于酯化狀態的PUFA 也可直接通過非酶氧化生成少數氧脂。 氧脂合成的一般機制是從PUFA 結構中去除敏感的氫原子， 并同時或隨后插入一個或多個氧分子。在酶介導的途徑中，酶活性位點上自由基的形成是必需的，環氧合酶（COX）的自由基形成于活性位點上的酪氨酸殘基， 而脂氧合酶（LOX）和細胞色素P450（CYP）表氧化酶的自由基分別形成于活性位點上的非血紅素鐵和血紅素鐵，非酶代謝也遵循類似的機制（Milne 等，2015）。

2.1 COX 途徑生成的氧脂對氧化應激的調節COX 存在組成性表達的COX-1 和誘導表達的COX-2 兩種亞型。以 ARA 為底物，COX 途徑生成的氧脂主要為2 系列的前列腺素和血栓素（TX），包 括 PGD2、PGE2、PGF2 和 PGI2 以 及 TXA2和TXB2。 患有乳房炎奶牛的乳腺組織中COX-2 的基因表達顯著提高， 導致其下游氧脂的生成模式發生改變（Ryman 等，2015）。許多研究表明，COX-2 活化后可導致ROS 的生成增加，而這與COX-2途徑衍生的氧脂有直接的關系 （Munoz 等，2015；Cho 等，2011）。 在炎癥期間，PGE2是 COX-2 途徑的主要下游產物，通過PGE2前列腺（EP）受體介導其作用。 研究表明，在阿爾茨海默癥模型中，大腦PGE2的產生提高了ROS 的生成和氧化應激的發展， 而EP2和EP3受體的缺失降低了這些變化（Montine 等，2002）。對人肝細胞的研究發現，在細菌脂多糖 （LPS） 誘導下，PGE2生成增加引起的ROS 的生成與EP4受體激活引起的NADPH 氧化酶（NOX）系統的活化有關（Sancho 等，2011）。 在低硒日糧和抗氧化酶活性下降時， 患有乳房炎和子宮內膜炎奶牛PGE2的生成增加。LPS 誘導的牛子宮內膜外植體和上皮細胞PGE2的生成與EP2和 EP4受體的表達增強有關（Herath 等，2009）。 在PG 脫氫酶的作用下，PGE2可降解為無活性的15-酮基 PGE2（15-keto PGE2）。 因此，可以通過提高該酶的活性促進PGE2的降解進而降低其對ROS 的誘導作用。 也有研究表明，硒添加可上調PG 脫氫酶的基因表達（Kaushal 等，2014）。

已知具有血管擴張功能的PGI2也具有調節氧化應激的作用。 在小鼠急性肺損傷模型中，PGI合成酶過表達通過增強抗氧化酶醌氧化還原酶1（NQO1） 的基因表達來減緩博來霉素誘導的氧化應激（Zhou 等，2011）。 在小鼠腦損傷模型中，添加PGI2激動劑貝前列素鈉提高了PGI 合成酶和PGI受體的基因和蛋白表達以及PGI2的生成，同時減緩了鋁誘導的SOD 活性的降低和丙二醛（MDA）生成的提高， 因而減緩了鋁誘導的氧化應激（Pan等，2015）。盡管氧化應激誘導的COX-2 的活化可提高PGI2的生成， 但同時氧化應激也具有抑制PGI 合成酶的作用。 對內皮細胞的研究發現，NO和超氧陰離子反應產生的ONOO-可通過硝酰化作用抑制 PGI 合成酶的活性 （Weaver 等，2001）。患有乳房炎奶牛的牛奶中以及患有子宮內膜炎奶牛的子宮和血漿中均發現了NO 的明顯提高（Li等，2010；Blum 等，2000）。

COX 途徑生成的PGD2可經脫水反應生成15-dPGJ2。 一方面，15-dPGJ2可激活過氧化物酶體增殖激活受體（PPARs）和抑制 NF-κB 信號通路下調COX-2 的基因表達， 降低促炎氧脂 （如PGE2）的生成，從而減緩氧化應激（Brigelius-Flohe和 Flohe，2017；Haskew-Layton 等，2013； Mendez和 LaPointe，2003） 。 另一方面，15-dPGJ2可通過激活抗氧化基因如血紅素加氧酶-1 （HO-1）、SOD、GSH-Px 以及鐵蛋白的表達促進抗氧化酶和抗 氧 化 劑 的 生 成 （ Shibata，2015；Lutzow 等 ，2008），減緩氧化應激。

2.2 LOX 途徑生成的氧脂對氧化應激的調節LOX 存在 5-LOX、8-LOX、12-LOX 和 15-LOX 四種亞型，超氧陰離子和H2O2均可使LOX 活化。LA和ARA 經LOX 途徑代謝可分別生成羥基過氧十八碳二烯酸（HpODE）和羥基過氧二十碳四烯酸（HpETE）， 這些中間代謝產物本身就屬于脂質氫過氧化物， 因而可導致氧化應激。 不穩定的HpODE 和HpETE 可進一步依次代謝為相應的羥基衍生物 （HODE 和 HETE） 和酮基衍生物（oxoODE 和oxoETE）。 研究表明，圍產期奶牛表現為氧化應激水平的進程性提高， 這可能與其乳腺組織中15-LOX 基因表達的顯著提高有關（Aitken等，2009）。 患有乳房炎奶牛的乳腺組織中 9-HODE 和 13-HODE 以及 5-oxoETE 的水平顯著提高（Ryman 等，2015），這提示了其上游相應的脂質氫過氧化物HpODE 和HpETE 的生成增加。 在牛主動脈內皮細胞中，13-HpODE 通過引起線粒體膜電位的喪失、 細胞色素c 的釋放和提高線粒體Fe2+的攝取誘導了線粒體 ROS 的產生（Dhanasekaran 等，2005）。在人和大鼠肺內皮細胞和平滑肌細胞中，15-HETE 誘導了ROS 的生成，主要來源于線粒體電子傳遞鏈和NOX 系統（Li等，2016）。在吞噬細胞和上皮細胞中，氧化應激誘導了 5-oxoETE 的生成 （Erlemann 等，2007），而5-oxoETE 作為趨化劑可導致單核細胞和中性粒細胞向炎癥部位的遷移， 這些細胞的呼吸爆發活動進一步加劇了氧化應激， 因而形成了氧化應激與炎癥之間的惡性循環。

LX 是在炎癥消退階段由ARA 經LOX 途徑代謝生成的一類氧脂，包括LXA4和LXB4兩種亞型，目前對LXA4的功能相對比較清楚，通過已知唯一的受體甲酰肽受體2（FPR2）介導其作用，具有促進炎癥消退和調節氧化應激的作用。 在細胞水平上，通過抑制NOX 蛋白復合體的組裝，LXA4能夠直接抑制白細胞依賴的超氧陰離子的生成（Hachicha 等，1999）。 LXA4對超氧陰離子生成的抑制作用同樣也表現在其他ROS 和RNS 上，例如，LXA4抑制了中性粒細胞 H2O2（Weinberger 等，2008）和 ONOO-的生成（Filep 等，2005）。 LXA4還可以通過提高核因子E2相關因子（Nrf2）依賴的抗氧化基因的表達來調節氧化應激。 研究表明，LXA4預處理缺氧再灌注心肌細胞增強了Nrf2 的核轉位，提高了HO-1 的mRNA 和蛋白表達以及其基因啟動子的活性（Chen 等，2013）。

在炎癥消退階段，DHA 經LOX 途徑可生成D 系列消退素（RvD）和 MaR，乙酰化的 COX-2 也可催化DHA 生成阿司匹林觸發RvD（AT-RvD）。在巨噬細胞中，RvD1可通過抑制p47 和 gp91 亞基的裝配和磷酸化抑制NOX 活性， 進而抑制ROS 的生成（Lee 和 Surh，2013）。 在嚙齒動物急性肺損傷模型中，RvD1和 AT-RvD1激活了 Nrf2 及其下游抗氧化基因的表達 （Posso 等，2018；Zhao等，2016）， 降低了髓過氧化物酶 （MPO） 的活性（Hu 等，2019）和 RNS 的生成（Wang 等，2011）。 在CCI4誘導的小鼠肝損傷模型中，RvD1通過提高細胞內還原型谷胱甘肽（GSH）的水平、SOD 的活性和HO-1 的基因表達發揮了對肝臟的抗氧化保護效應（Chen 等，2016）。 研究表明，在小鼠肝損傷（Li 等，2016）、 腎損傷 （Qiu 等，2019） 和皮膚炎（Cezar 等，2019）模型中，MaR1處理顯著降低了超氧陰離子的生成和組織損傷。

2.3 CYP 途徑生成的氧脂對氧化應激的調節CYP 途徑生成的氧脂對氧化應激的調節作用與其所代謝的底物有很大的關系。 研究表明，以LA為底物生成的環氧十八碳烯酸（EpOME）提高了ROS 的生成和促炎反應及血管內皮細胞的通透性（Viswanathan 等，2003），而且當 EpOME 在可溶性環氧化物水解酶的作用下轉變為二羥基代謝物（DiHOME） 時， 內皮細胞的通透性進一步增強（Slim 等，2001）。 相反， 以 ARA 為底物生成的環氧二十碳三烯酸（EET）對內皮細胞及其他細胞具有抗氧化和抗凋亡的作用 （Dhanasekaran 等，2006）， 這種效應與其激活Nrf2 進而引起抗氧化酶的基因表達提高有關（Liu 等，2015）。 然而，以ARA 為底物生成的另一種氧化脂質20-HETE 可提高線粒體ROS 的生成和激活NOX 系統（Han等，2013）。 當奶牛患有乳房炎時，牛奶中EpOME的水平提高， 血漿中11，12-EET 的水平降低，牛奶和血漿中20-HETE 的水平提高（Mavangira 等，2015），提示氧化應激水平提高。

當以EPA 作為底物時， 經CYP 途徑可生成18（R）-羥基過氧二十碳五烯酸（HpEPE），這一反應也可被乙酰化的 COX-2 催化（Serhan，2014）。18（R）-HpEPE 進一步在 LOX 的催化下生成具有促進炎癥消退的E 系列消退素（RvE）。 有資料表明，RvE 可直接抑制中性粒細胞中超氧陰離子的生成，這種效應主要是通過抑制NOX 蛋白的組裝進而抑制其活性實現的（Takamiya 等，2012）。

3 總結

綜上所述，PUFA 代謝生成的氧脂對氧化應激具有重要的調節作用，概括而言，主要是通過調節線粒體ROS 的生成、NOX 系統以及氧化還原敏感的信號通路實現對氧化應激的調節。 在動物生產過程中， 氧化應激是影響生產性能及健康的一個重要因素， 上述研究成果盡管多數集中于醫學領域， 但對于在動物生產過程中通過日糧營養干預策略控制氧脂的生物合成進而調節氧化應激具有重要的借鑒意義和參考價值。 目前僅有為數不多的研究探討了動物（奶牛）在炎癥條件下的氧脂生成模式， 并沒有針對性地探討其對氧化應激的調節， 而這必將成為通過調節氧化應激進而優化動物免疫功能最終避免動物疾病發生和保證動物健康的一條新的途徑。