TGF-β1/CTGF信號通路及其在黃韌帶肥厚中作用機制的研究進展

楊信強，陳鋒，閆乾，范曉茜，梁雄欽，高森

(1.廣西中醫藥大學研究生院，南寧 530001； 2.廣西中醫藥大學附屬瑞康醫院脊柱外科，南寧 530001)

腰椎管狹窄癥是導致下腰痛的常見原因之一[1]。自1913年埃爾斯伯格首次描述黃韌帶肥厚導致腰椎管狹窄癥及其相關神經癥狀以來，黃韌帶肥厚已被確定為引起腰椎管狹窄癥的主要原因之一[2]。相關研究表明，增生的黃韌帶表現為退化或彈性纖維的丟失以及膠原纖維的增加、鈣化、骨化和軟骨間變性[3]。黃韌帶肥厚是一種與年齡、活動水平和機械應力程度密切相關的多因素疾病[4]。轉化生長因子-β(transforming growth factor-β,TGF-β)是黃韌帶肥厚變性過程中的主要因子[5]。有研究表明，TGF-β1是組織纖維化發病的關鍵因素，在腰椎管狹窄癥的增生性退行性黃韌帶組織中高表達[6]。然而，TGF-β1與黃韌帶肥厚之間的分子生物學機制，尤其是與黃韌帶細胞中膠原蛋白表達的關系尚不完全清楚[7]。

近年來有研究發現，肥厚的腰椎黃韌帶細胞中結締組織生長因子(connective tissue growth factor,CTGF)表達水平高于正常黃韌帶細胞[6]。CTGF作為促纖維化因子參與黃韌帶組織纖維化過程，如細胞增生、轉移、黏附和細胞外基質積累[8]。據報道，CTGF還參與TGF-β1的生物活性，如TGF-β1與CTGF結合已被證明可調節細胞增殖和細胞外基質組分的合成[9]。TGF-β1還可誘導人皮膚成纖維細胞中CTGF信使RNA(messenger RNA,mRNA)的表達。因此，TGF-β1/CTGF信號通路在黃韌帶增生肥厚過程中發揮重要作用，但TGFβ1/CTGF信號通路調控分子的作用機制目前仍不清楚。現就TGF-β1/CTGF信號通路在黃韌帶肥厚中的作用機制進行綜述。

1 TGF-β1/CTGF信號通路概述

TGF-β1/CTGF信號通路是人體細胞內信號轉導的重要通路之一，在人體各組織器官的纖維化過程中均起重要作用。如在肝損傷過程中，肝細胞活化會導致TGF-β1合成增加，隨著纖維化程度加重，可在各種多形肝結構中發現CTGF過量產生[10]。在卵巢疾病，如卵巢囊腫周圍組織纖維化過程中，同樣發現TGF-β1、CTGF及細胞外基質等因子表達升高[11]。在肺纖維化過程中，有學者發現干擾素γ-1b可明顯降低TGF-β1和CTGF的mRNA表達，從而改善肺組織的纖維化程度[12]。在黃韌帶細胞中，TGF-β1可促進CTGF表達，進而導致Ⅰ型和Ⅲ型膠原纖維的表達升高[13]。

1.1TGF-β1/CTGF信號通路 黃韌帶纖維化是一個復雜的過程，機械損傷、缺氧和年齡增加等均可激活各種引起黃韌帶纖維化的信號通路，TGF-β1是一種廣泛存在于人體組織細胞的纖維化因子，參與黃韌帶組織損傷修復、纖維化增生肥厚的病理過程[14]。TGF-β1可促進黃韌帶間質細胞產生膠原纖維，特別是對Ⅱ型膠原的生成發揮重要作用。而CTGF作為TGF-β1信號通路的重要下游效應分子，對促進黃韌帶細胞的增生和膠原纖維的合成發揮重要作用[6]。TGF-β1/CTGF信號通路間主要有兩條轉導通路：①TGF-β1/Smads/CTGF信號通路，該通路主要通過TGF-β1激活Smads依賴和非依賴途徑進行信號轉導，繼而Smads蛋白將信號轉導至細胞核內，激活CTGF的啟動基因，在細胞核內轉錄成mRNA，并在胞質中合成CTGF相關蛋白，進一步對纖維化相關信號進行轉導；②TGF-β1/促分裂原活化的蛋白激酶(mitogen activated protein kinase，MAPK)/CTGF信號通路，其包含胞外信號調節激酶(extracellular signal-regulated kinase，ERK)1、ERK2、p38、c-Jun氨基端激酶(c-Jun N-terminal kinase，JNK)4條通路。目前研究認為，黃韌帶纖維化與p38 MAPK通路關系密切，4條通路之間可相互抑制、相互協同，共同調節TGF-β1/MAPK/CTGF信號通路的信號轉導[15]。因此，在黃韌帶肥厚過程中TGF-β1/Smads/CTGF信號通路和TGF-β1/MAPK/CTGF信號通路共同參與TGF-β1/CTGF信號通路的信號轉導，在黃韌帶肥厚增生和纖維化過程中發揮重要作用。

1.2TGF-β和CTGF信號分子 目前研究發現TGF相關的分子共有5種亞型：TGF-β1、TGF-β2、TGF-β3、TGF-β4和TGF-β5，但在哺乳動物體內僅發現3種確定的結構亞型：TGF-β1、TGF-β2和TGF-β3[15]。TGF-β1、TGF-β2在骨骼中占比較高，而TGF-β3在間充質干細胞分化形成的細胞中比例較高[13]，從結構上分析，這3種亞型的結構存在一定同源性，而且在功能上存在一定的相關性。TGF-β1是損傷修復過程中作用最顯著的因子之一。TGF-β1是與人體免疫系統相關，由體內的免疫和非免疫細胞通過分泌的方式產生的一種多肽，其分泌方式分為自分泌和旁分泌等，該物質具有“激素樣活性”的特征和屬性[14]。TGF-β1的結構是同質二聚體的形式且無活性，同時，TGF-β1可與前體相關的蛋白結合，使其與細胞表面受體相結合從而介導生物學效應[16]。

TGF-β1與CTGF之間可相互影響，CTGF是TGF-β1下游的效應分子。盧昌懷等[6]研究首次發現在黃韌帶發生損傷早期，黃韌帶細胞釋放的TGF-β1可對CTGF發揮調控作用，TGF-β1通過影響CTGF的表達協同促進黃韌帶增生和纖維化，外源性TGF-β1可促進CTGF、膠原纖維的表達。而加入CTGF阻斷劑后，CTGF及膠原蛋白的表達水平均下降。因此認為，在機械應力導致的微損傷情況下，黃韌帶細胞通過釋放TGF-β1促進CTGF蛋白表達，進而促進膠原蛋白的生成，導致黃韌帶組織纖維化。曹延林[13]研究發現，抑制CTGF蛋白表達可降低細胞外基質中Ⅰ型、Ⅲ型膠原蛋白和纖維連接蛋白水平，同時TGF-β1的表達也降低，因此認為CTGF的表達水平影響TGF-β1在黃韌帶細胞中的功能，兩者相互影響。有研究認為，大多數TGF-β1的表達涉及一定水平的CTGF參與，如細胞外基質成分的刺激，成纖維細胞、成骨細胞、星形膠質細胞的增殖，以及傷口愈合和纖維化等[17-18]。CTGF被認為是目前纖維化因子中成纖維活性最強的因子之一，TGF-β1對CTGF表達的調控是Smads蛋白家族和MAPK蛋白家族共同參與的結果[19]。

1.3TGF-β1/Smads/CTGF信號通路 目前Smads蛋白家族被認為至少包含9個成員，分別是Smad1～Smad8以及Smad10，根據功能不同可分為受體激活型(R-Smad)、受體通用型(Co-Smad)和受體抑制型(I-Smad)三種。R-Smad包含Smad1/2/3/5/8，Co-Smad包含Smad4/10，而I-Smad包含Smad6/7[20]。Smads家族蛋白對纖維增生的形成和細胞外基質沉積有促進作用，與纖維增生性瘢痕中的過度增殖、分化、遷移和凋亡等生理病理過程密切相關[21]。Smads家族蛋白是TGF-β1下游的一種重要信號分子，可在TGF-β1的作用下進行激活，將TGF-β1分子信號通過細胞表面的受體傳遞至細胞核內[22]。一般認為TGF-β1/Smads是一種簡單、線性的信號轉導通路。

TGF-β1/Smads/CTGF信號通路是TGF-β1發揮生物效應的一條重要通路，TGF-β的作用是通過細胞質Smads蛋白的磷酸化來介導[23]。TGF-β家族蛋白通過與兩對跨膜激酶、Ⅰ型和Ⅱ型受體的四聚體細胞表面復合物結合啟動細胞內信號轉導[24]。TGF-βⅡ型受體可識別并結合TGF-β，但無法激活Smad2/3，而Smad2和Smad3是參與TGF-β信號通路的主要分子，TGF-βⅠ型受體能激活Smad2/3，但不能結合TGF-β，因此，TGF-β先與TGF-βⅡ型受體結合，通過Ⅱ型受體激活Ⅰ型受體，進而通過胞質Smad2/3的磷酸化進行介導，為TGF-β的蛋白信號轉導提供基礎[25]。有研究發現，在CTGF的啟動子上存在Smads蛋白的結合位點，提示Smads信號轉導通路可能參與TGF對CTGF表達的調節[15]。

1.4TGF-β1/MAPK/CTGF信號通路 除激活Smads信號通路外，TGF-β1還能激活MAPK通路中的成員和其他相關酶[26]。MAPK通路參與細胞增殖、分化、凋亡以及肥厚等病理生理過程，同時在創傷愈合過程中也發揮重要作用。MAPK通路激活機制的一個重要線索是可被蛋白酪氨酸磷酸酶CD45或蛋白絲氨酸/蘇氨酸磷酸酶PP2A滅活[27]。MAPK可將細胞外膜刺激產生的信號通過跨膜轉運傳遞至細胞核內，從而在細胞的基因表達、增殖、分化以及對外部環境的應激中發揮重要作用[28]。機械創傷、活性氧類等均可促進MAPK通路激活[29]。

近年來研究發現，CTGF的表達受到MAPK通路的調控。MAPK信號通路是TGF-β1進行信號轉導的另一條重要通路。目前在哺乳動物的細胞中發現4條與MAPK相關的信號通路：ERK1、ERK2、p38、JNK通路；前3條通路是促纖維活性信號，而JNK通路則是抑制纖維活性功能的信號[30]。ERK1通路在MAPK通路研究中是最早被發現的信號通路，也是 MAPK已知通路中最主要的信號通路，ERK信號通路主要由5種蛋白激酶(ERK1～5)構成，目前研究最廣泛的為ERK1/2。多種細胞外刺激可激活ERK信號通路，激活途徑主要是Ras、Raf、絲裂原活化ERK(mitogen-activated extracellular signal-regulated kinase，MEK)、ERK。Ras是Raf的上游激活蛋白，當多種細胞外刺激(如機械損傷、活性氧類及炎癥因子刺激)激活ERK通路后，Ras開始活化并與其受體結合，進一步激活細胞膜上的Raf。激活后的Raf與信號通路中的“樞紐”MEK結合，磷酸化MEK后激活MEK。MEK活化后磷酸化TEY基，使ERK活化。而活化后的ERK轉移至細胞核內，激活相關核酸和轉錄因子，通過影響細胞的轉錄和表達調節細胞功能[31]。ERK2信號通路是最新發現的一個MAPK通路，Schwebs等[32]研究發現，ERK2缺乏會導致葉酸和cAMP趨化性的完全喪失，表明ERK2在MAPK信號通路的轉導過程中不可或缺，Ras/Raf可能參與ERK2通路的調節。JNK通路存在3種亞型：JNK1、JNK2及JNK3。JNK通路又被稱為應激活化蛋白激酶信號通路，可以被多種應激因子激活，如脂多糖、腫瘤壞死因子-α、氧化應激。活化后的JNK進入細胞核與轉錄因子相結合，參與相應基因的表達[33]。

2 TGF-β1/CTGF信號通路在黃韌帶肥厚中的作用機制

在黃韌帶增生肥厚過程中各種因素均可導致TGF-β1和CTGF高表達，兩者又協同促進黃韌帶細胞中膠原纖維的表達。其中TGF-β1/Smads/CTGF和TGF-β1/MAPK/CTGF信號通路在黃韌帶增生、肥厚過程中發揮重要作用，尤其是p38 MAPK通路目前被認為是調控CTGF表達的關鍵通路，對選擇性阻斷TGF-β1/MAPK/CTGF信號通路、抑制黃韌帶肥厚增生發揮重要作用。

2.1TGF-β1和CTGF在黃韌帶肥厚中的作用機制

2.1.1TGF-β1與黃韌帶肥厚 在黃韌帶細胞中，由于脊柱的機械應力刺激，TGF-β1被激活，活化的TGF-β1與其受體相結合，通過特定的異四聚體受體復合物發出信號，激活經典的Smads信號通路和MAPK信號通路以及一些小的GTP酶活化，進而激活纖維化基因表達，如編碼細胞外基質和平滑肌肌動蛋白相關基因[34]，這些基因的表達導致膠原蛋白表達增強，特別是Ⅱ型膠原纖維的蓄積增生，而Ⅱ型膠原纖維的顯著增生可能是導致黃韌帶增生、肥厚的重要原因之一[35]。目前TGF-β1在黃韌帶組織發生纖維化過程中的作用機制以及在損傷、炎癥以及纖維化過程中的分子機制尚不完全明確[7]。

2.1.2CTGF與黃韌帶肥厚 CTGF是富含半胱氨酸的基質蛋白，參與生物細胞的調控過程。近來研究發現，在腰椎肥厚的黃韌帶中CTGF高表達，且在黃韌帶肥厚進程中發揮重要作用，盧昌懷等[6]將正常黃韌帶組織和發生增生肥厚的黃韌帶組織細胞進行細胞外基質培養并進行比較，結果顯示，增生肥厚組中的CTGF水平高于正常組，且CTGF的表達水平與增生肥厚程度呈正相關。CTGF是一種促纖維化因子，參與人體多種組織器官的纖維化過程，同時也參與新生血管形成、組織創傷修復等[36]。

2.2TGF-β1/Smads/CTGF信號通路與黃韌帶肥厚 Smads通路在黃韌帶組織損傷的修復、愈合以及瘢痕形成中扮演重要角色，是細胞纖維化過程中TGF-β1進行信號轉導的主要通路。當黃韌帶細胞受到機械應力等因素刺激時，可通過自分泌或旁分泌的形式釋放TGF-β1，活化的TGF-β1通過與特定的受體相結合激活Smads信號通路，Smad2/3被激活后，將信號由細胞膜外轉導至細胞核內，Smads蛋白通過結合CTGF的啟動子激活CTGF蛋白表達，進而促進膠原蛋白生成，當黃韌帶細胞受到過度刺激時，CTGF出現過表達，最終導致黃韌帶增生和纖維化[37]。但并非所有細胞CTGF的表達均通過Smads信號通路應激上調。有研究發現，Smads通路作用廣泛，特異性不明顯[38]。

2.3TGF-β1/MAPK/CTGF信號通路與黃韌帶肥厚

p38 MAPK通路被認為是MAPK的經典通路，在TGF-β1調控CTGF的過程中特異性最顯著[39]。p38 MAPK一般位于細胞質和細胞核，p38 MAPK通路主要參與細胞核的作用，主要體現在細胞生長、凋亡過程中的信號轉導。同時在細胞的炎癥調控和應激反應也發揮重要作用[40]。

當各種因素(如機械應力、年齡增長、微損傷)刺激使黃韌帶發生退變時，黃韌帶細胞中的TGF-β1增加，導致TGF-β1激活Smads信號通路，進一步促使Smad2/3活化。活化后的Smad2/3是TGF-β激活激酶1的上游激酶，TGF-β激活激酶1被激活后進一步激活MAPK激酶6/MAPK激酶3，從而激活p38 MAPK信號通路。p38 MAPK被激活后形成磷酸化p38 MAPK，其具有多種細胞功能，如參與多種轉錄因子的磷酸化、細胞表面受體的表達、多種蛋白的合成和細胞骨架重構等。磷酸化p38 MAPK進一步活化，形成p38 MAPK，最終使細胞信號通過p38 MAPK通路傳遞至細胞核內[41]。由于MAPK信號通路的激活和Smads蛋白的磷酸化可相互獨立發生，TGF-β1調節CTGF表達的過程可能是Smads通路和MAPK通路共同作用的結果。

在黃韌帶肥厚的細胞信號轉導中，p38 MAPK通路一旦被抑制可直接影響TGF-β1/MAPK/CTGF信號通路的轉導過程。曹延林[13]在研究p38 MAPK通路介導的腰椎黃韌帶肥厚增生實驗中，通過對不同MAPK信號通路進行阻斷，發現ERK和JNK通路阻斷后，CTGF mRNA、Ⅰ型膠原mRNA和Ⅲ型膠原 mRNA表達不受影響，而加入p38阻斷劑后，上述3種mRNA的表達水平受到明顯抑制，說明p38 MAPK通路是影響TGF-β1調控CTGF表達的關鍵通路。而加入TGF-β1后受到抑制的CTGF表達再次上調，說明在黃韌帶細胞中TGF-β1通過p38信號通路調節CTGF的表達。但需要注意的是，該實驗中可能有其他信號通路參與TGF-β1對CTGF的上調，如Smads信號通路。

3 小 結

在人腰椎黃韌帶細胞損傷修復、增生肥厚以及瘢痕形成過程中，TGF-β1/Smads/CTGF和TGF-β1/MAPK/CTGF信號通路均參與黃韌帶細胞的信號轉導，促使CTGF表達增加，進而誘導細胞外基質(如膠原蛋白、纖維連接蛋白和糖蛋白)的產生，引起黃韌帶細胞纖維化，從而導致黃韌帶細胞肥厚退變。由于Smads通路作用廣泛，特異性較差，目前研究普遍傾向于通過阻斷p38 MAPK通路選擇性地抑制CTGF蛋白表達，推測敲除p38 MAPK基因或使用p38 MAPK特異性阻斷劑阻斷p38 MAPK信號通路可減少CTGF蛋白以及相關膠原纖維等的產生，從而減少黃韌帶細胞肥厚的發生。