CAR-NK細胞療法臨床轉化的倫理學挑戰及應對措施*

張李婷 高春俠 陳 鳴 楊 爽 馬文兵②

嵌合抗原受體 (chimeric antigen receptor,CAR)修飾的T(CAR-T)細胞療法發展迅速，在治療惡性腫瘤，特別是血液系統惡性腫瘤方面取得了巨大的成就。但是伴隨著對血液腫瘤顯著療效的同時，CAR-T細胞療法也存在著一些問題，如脫靶效應、細胞因子風暴、插入突變等，并且對實體瘤尚未取得顯著療效。CAR修飾的自然殺傷(natural killer,NK)細胞由于可以避免這些缺點而備受關注。目前，臨床前和臨床研究表明，CAR-NK細胞療法可能具有顯著的抗腫瘤作用，相較于 CAR-T 細胞療法，CAR-NK細胞療法可補足相關劣勢，可以靶向多種致病性抗原，具有更強的細胞毒性，并且可以被更好地控制，極大地減輕細胞因子風暴的風險。此外 NK 細胞來源廣，并不需要依賴患者自身特異性免疫細胞[1]。然而，CAR-NK細胞療法仍然面臨著一些研發挑戰，如原代NK細胞的體外擴增和激活，NK細胞產品的儲存和運輸困難，轉導效率低等。同樣，在臨床轉化中也出現了潛在的倫理問題，如臨床試驗中所涉及的潛在利益和風險，以及研究人員個人學術發展和患者利益之間的平衡。因此，研究人員應在堅持保護患者權益等倫理原則的基礎上，探討CAR-NK細胞療法在臨床轉化中的倫理問題，對提高治療效果具有重要意義。

1 CAR-NK細胞療法概況

NK細胞是一群不同于T、B淋巴細胞的大顆粒淋巴細胞，占外周循環淋巴細胞的10%～15%，細胞表型為CD56+CD3-，根據細胞表型及功能分成兩個亞群：有殺傷活性的CD56dimCD16+(約占90%)和具有免疫調節作用的CD56brightCD16-亞群(約占10%)。在循環系統中的 NK 細胞通常處于休眠狀態，一旦被激活，它們會滲透到組織中，分泌穿孔素及腫瘤壞死因子，攻擊腫瘤細胞。而這一動態平衡主要受 NK 細胞表面受體蛋白的調控：殺傷細胞活化受體和殺傷細胞抑制受體。NK 細胞的活化狀態，執行細胞的脫粒、細胞因子釋放和細胞殺傷功能是抑制信號和活化信號綜合的結果[2]。

CAR-NK又稱為加強版的NK細胞，是通過基因工程手段修飾使其表達CAR，將識別腫瘤細胞表面抗原的抗體(或受體)與激活免疫細胞所需的信號分子連接，可以突破抑制受體的限制而激活NK細胞，以增強NK細胞對腫瘤細胞的特異性殺傷。CAR-NK細胞療法流程是：首先抽取患者或健康供者外周血，分離、獲得外周血單個核細胞，然后在體外大量擴增NK細胞；其次通過基因工程修飾，在NK細胞表面表達能夠和腫瘤特定抗原結合的CAR；最后回輸至患者體內，能夠特異性識別帶有特定抗原的腫瘤細胞，引發免疫反應，從而達到清除腫瘤細胞的目的。CAR-NK細胞療法目前還處于試驗研究階段，在臨床前和臨床試驗中已被證明可以殺死血液和實體腫瘤細胞，顯示了其作為一種具有廣泛臨床應用前景的現成產品的潛力[3]。本文重點介紹了臨床前向臨床轉化、提高CAR-NK細胞療法安全性和有效性的新策略，并描述了CAR-NK細胞療法臨床轉化面臨的挑戰。

2 CAR-NK細胞療法臨床轉化中面臨的問題

2.1 CAR-NK細胞療法臨床轉化風險/獲益倫理困境

2.1.1 CAR-NK細胞療法臨床轉化面臨的風險

CAR-NK細胞療法雖然具有巨大的潛力，但要擴大其臨床應用，仍有一些根本性的問題需要解決。首先，目前的CAR是為構建CAR-T細胞而設計的，因此不是應用于NK細胞的最佳選擇。CAR結合表位的位置及其與CAR-NK細胞表面的距離影響其結合抗原和激活CAR-NK細胞的能力[4]。其次，外周血NK細胞的使用受到限制，因為原代NK細胞通常很難進行基因修飾；因此，即使使用病毒載體，轉導效率也非常低，而且在過繼轉移設置下，同種異體NK細胞只能存活幾周，限制了它們的抗腫瘤效果[5]。再者，NK細胞對凍融過程敏感，解凍后NK細胞的存活率和細胞毒性顯著降低[6]。體內注射后曾表現出較差的擴增和持久性，成熟的人NK細胞壽命有限，半衰期估計為14天[7]，這限制了它們的臨床效果[8]。最后，異基因NK細胞可能被T細胞污染，導致移植物抗宿主病(graft-versus-host disease,GVHD)或淋巴增殖障礙[9]。對于CAR-NK細胞療法在臨床轉化中存在的上述安全問題，還需要大量研究，進一步建立質量監管規范。

2.1.2 CAR-NK細胞療法無普遍適用的風險/獲益評估標準

對于CAR-NK細胞療法臨床研究的風險/獲益評估，目前還沒有普遍適用的標準。就抗腫瘤的效果而言，其應用于人體Ⅰ期臨床試驗的獲益尚不明確。Shimasaki等[10]發現經CAR-NK細胞療法治療后，異種移植白血病的生長速度明顯減慢。近期，來自德克薩斯大學M.D.安德森癌癥中心等機構的研究人員在《新英格蘭醫學雜志》上公布了美國首個CAR-NK細胞臨床試驗(NCT03056339)的結果。研究顯示，用臍帶血來源的CAR-NK細胞療法治療既往接受過大量治療的復發或難治性非霍奇金淋巴瘤和慢性淋巴細胞白血病患者后，大多數患者產生了治療效果，且未出現主要的毒性作用。在參與該研究的11位患者中，有8位(73%)對治療有反應，其中7位完全緩解，這意味著他們在中位隨訪13.8個月時無疾病進展。輸注后1個月內CD19對CAR-NK細胞療法的反應明顯，并且在輸注后1年內確認了這項治療的持久性[11]。但是該研究中11名患者均使用新鮮回輸的NK細胞，若想真正成為一種“現貨型”的產品，研究者還需確認凍存后的細胞是否可以達到相同的療效。CAR-NK細胞療法目前不僅對血液腫瘤有效，還對實體腫瘤的治療顯示出巨大的前景。

盡管在大多數的抽象意義上，客觀療效可能不等同于“獲益”，但能被外部標準所接受，是一項衡量變化的客觀指標。此外，參與Ⅰ期臨床試驗的患者除了腫瘤的明顯縮小，可能還有其他的獲益，盡管這些獲益很難被記錄。一些研究者觀察到參與Ⅰ期腫瘤臨床試驗的患者生存質量在參與試驗的過程中得到改善，但這些研究的設計者并不清楚生活質量的改善是否與藥物本身有關，或者與Ⅰ期臨床試驗過程中與醫務人員的頻繁接觸(因此而獲得更多的控制癥狀的機會)有關，或者與入組患者抱有希望從試驗中獲益的心理狀態有關。

風險/獲益的另一個方面是初次接受新的治療方案的患者可能出現嚴重的副作用。一個特定的治療方案在進入Ⅰ期臨床試驗時，由于沒有應用于人體的數據供參考，其風險并不能準確量化，必須用大量的臨床前數據以及良好的試驗設計(安全初始劑量、小心的劑量遞增、實時安全監測)來降低風險。有臨床研究表明，由于CAR-NK細胞療法對CD19+腫瘤細胞的特異性殺傷力，治療后小鼠的腫瘤負擔明顯降低，但只有短暫的抗腫瘤作用，后期出現復發[10]。因此，基于上述客觀數據，CAR-NK細胞療法存在的上述安全問題還需要大量研究，進一步建立該療法風險/獲益評價體系。

2.2 CAR-NK細胞療法準入不嚴和研究者能力不夠

隨著CAR-NK細胞療法技術的快速發展，越來越多的醫療機構和研究人員加入到這一療法的探索中。CAR-NK細胞療法制備工藝復雜，過程中的無菌操作、細胞純度、制備成品安全性等質量控制對后期的療效有著重要影響，所以確保生產過程的標準化和自動化，做到藥效和風險可控是首要任務。研究平臺條件是否達標將直接影響著治療效果，如果入院標準較弱，其所用設備不符合規定的細胞免疫治療技術要求，不僅會使患者錯過最合適的治療機會，也違反醫德原則中的無害原則，如2016年的“魏則西事件”以及2017年第一例CAR-T細胞療法醫療糾紛案件。面對更多尚未普遍應用于臨床的醫學創新，如何厘清研究機構所應承擔的責任迫在眉睫，亦應在科研探索、產業發展、醫學倫理與患者安全之間做權衡。

CAR-NK細胞療法已被作為新的抗癌利器應用于臨床試驗，研究成果也日益豐富，但其有效性和安全性大多仍處在論證階段，個別患者在細胞免疫治療方面差異很大，存在出現嚴重并發癥的較高風險，如果研究人員專業水平低，他們可能無法充分預測和解釋患者的潛在風險并在意外情況下做出及時的專業判斷，從而無法保證患者的安全。如果降低科研人員的道德準入要求，只一味追求研究成果，無視患者利益，或者不告知患者治療過程中面臨的風險，或者未經同意就公布研究數據，則嚴重違反公平正義、尊重自主隱私的倫理原則。

2.3 CAR-NK細胞療法監管制度缺陷

細胞治療，既涉及到細胞制品的制取，又涉及到臨床應用，該作為“藥品”還是“技術”來監管，多年來爭論不斷。我國在過去幾十年里一直在探索適合國內情況的細胞療法監管策略，但相關的倫理規范建設并不完善。美國、歐盟、日本對于細胞治療產品的概念界定的側重點各有不同，美國注重界定制藥方式；歐盟側重于臨床應用范圍，可用于疾病的預防、診斷或治療，并且強調了處理方法和生物學特性；日本則強調了細胞的來源為自體或同源，對細胞進行的人工基因操作技術和主要用于治療與再生修復。目前，我國對于細胞治療產品存在兩種不同監管路徑，一種是按照藥品申報，在藥監局申請下開展規范的注冊臨床試驗；另一種是以第三類醫療技術的形式開展臨床試驗，屬于衛生部門管轄，無須向藥品監管部門備案。目前我國大多數細胞治療的臨床研究仍是以第三類醫療技術的形式開展的非注冊臨床研究，在開展臨床研究前并未向藥品審評部門提交過臨床試驗申請。這種“雙軌制”管理使得細胞治療產品權責歸屬不清的狀況帶來諸多混亂和風險，該風險最終又是由患者來承擔。

2019年衛健委發布的《體細胞治療臨床研究和轉化應用管理辦法(試行)》指出，體細胞療法在臨床上的應用可以直接應用于患者。這可能會使得醫院向患者使用不安全和無效的干預措施。在大多數情況下，細胞療法的市場應用比臨床應用的批準需要更多關于安全性和有效性的數據。因此，制藥公司幾乎沒有動力投資于昂貴的晚期臨床試驗[12]。通常情況下，細胞治療臨床試驗需要有嚴重疾病的患者作為受試者。在公眾意識和參與度較低的情況下，很難招募足夠的受試者進行細胞治療臨床試驗。醫療機構進行的臨床體細胞研究和應用將進一步搶奪制藥公司的臨床學科資源，并可能阻礙體細胞治療的進展。

3 CAR-NK細胞療法臨床轉化倫理問題的解決措施

3.1 規范CAR-NK細胞療法臨床轉化流程

CAR-NK制備工藝復雜，過程中的無菌操作、細胞純度、制備成品安全性等質量控制對后期的療效有著重要影響，所以確保生產過程的標準化和自動化，做到藥效和風險可控是首要任務。

首先，確保NK細胞來源的安全性。NK細胞來源廣泛，如外周血、臍帶血、人胚胎干細胞、人誘導多能干細胞和NK細胞系，細胞來源和臨床程序必須符合所有適用的法律、法規和道德要求。CAR-NK細胞療法中NK細胞需要在體外進行處理，并采用回輸過程，保證細胞來源、治療和質量控制的準確性，才能有效地符合醫學倫理學中的無傷害原則。因此，具體的試驗方案應該按照共同的指導原則進行規范。必須確定非細胞系的特定來源，還應提供細胞類型、細胞形態以及與標記相關的確切信息。同種異體細胞的免疫治療需要詳細的免疫學檢測方法和結果。此外，NK-92等細胞還需要了解其病史、親本文庫的子代數量和允許代數，并保持其細胞表型和功能穩定性。如果要在體外培養細胞，則需要對細胞培養和檢測進行嚴格的監測。確保用于CAR-NK細胞療法的NK細胞的高質量，可以避免違反無害的倫理原則。

其次，確保NK細胞存活時間。NK細胞在體內存活時間較低，限制了它們的抗腫瘤效果，合適的NK細胞亞群的選擇性擴增及其在合適類型腫瘤中的應用值得探討。臍帶血來源的NK細胞或記憶樣NK細胞比外周血來源的NK細胞壽命更長，因此可能是NK細胞治療的理想來源。聯合應用細胞因子如白細胞介素-12(inter leukin-12,IL-12)、IL-15和IL-21可能進一步增強這些NK細胞在體內的增殖和持久性[13]。研究表明，引入可誘導的caspase 9自殺系統和小分子二聚體可以誘導CAR-NK細胞凋亡，降低風險[14]。盡管如此，這種方法的必要性還需要在更多的研究中得到驗證。

再次，設計適合NK細胞的CAR結構。CAR是提高NK細胞殺傷活性的有力工具，然而，僅有少數研究設計了基于NK細胞特性的CAR結構。因此，設計適合NK細胞的CAR優化結構，才能有效地促進了NK細胞的體內擴增和存活，提高CAR-NK細胞療法的療效。有學者構建了9個專門用于NK細胞殺傷黑色素瘤的CAR，特別是聚焦于細胞內刺激適配分子，以尋找NK細胞激活和細胞毒性的優化CAR結構[15]。

從次，提高NK細胞轉導率。目前常見的可以用來轉染NK細胞的病毒基因載體主要包括：逆轉錄病毒、腺病毒、慢病毒、腺相關病毒、仙臺病毒等。逆轉錄病毒以及慢病毒是CAR-NK細胞構建過程中比較常用的載體，慢病毒轉導效率低，非病毒載體克服了這些缺點，被認為是一種安全和負擔得起的轉導選擇[2]。

最后，確保NK細胞解凍后存活率。NK細胞解凍后存活率和活性降低問題，一些研究團隊發現，通過添加IL-2可以部分恢復冷凍NK細胞的活性[1]。為了使CAR-NK細胞療法作為現成的產品具有可行性，必須探索最佳的冷凍保存策略。

只有規范CAR-NK細胞療法臨床轉化全流程，以上技術問題能夠解決，才可能最大程度地避免受試者受到不必要的傷害。另外，CAR-NK細胞療法臨床研究轉化過程需要由受過完整的科研訓練、能勝任此工作的人員來指導，尤其對于那些在研究過程中有可能會給研究對象帶來傷害的研究更需要研究者進行周密的設計，以盡量避免傷害。研究者也應了解，一旦預先估計研究對象在參與研究的過程中有可能受到生理上的傷害、心理上承受壓力或者有可能致傷、致殘，甚至致死時，應隨時停止研究。以患者為試驗對象時，受試對象只限于患者所患疾病的范圍內，否則是違反倫理的；以健康人為受試對象時，應保證受試者的健康不會受到損害。

3.2 提升CAR-NK細胞療法研究人員職業素養

科研平臺是高水平科研工作的基礎條件，因此加強醫療機構準入管理，是保證CAR-NK細胞療法安全有效的重要保障。安全性應該成為藥品/醫療技術的“定海神針”，應當與有資質的機構合作，按照嚴格的標準開展臨床前安全性評價和有效性評價。這不僅是對一般患者的負責，也有助于基礎科學知識的獲得。首先要保證技術準入要求，科研平臺擁有細胞療法的環境以及設備。同時強調機構主體責任，明確開展臨床研究的醫療機構承擔主體責任，醫療機構主要負責人是本機構臨床研究管理的第一責任人。醫療機構為其他機構提供技術支持、研究場所，協助進行志愿者招募的，本機構及參與人員同樣承擔相應責任。

癌癥患者渴望獲得有效的治療藥物是人之常情，但科研人員不能因為社會期待就放棄嚴謹的科學態度。科研者重視保護受試者的利益，并真正做到科學研究的目的服從于保護受試者的權益。在權衡受試者的風險-受益比時，也應考慮對社會群體的利益以及對專業知識的貢獻。受試者的風險程度不能大于研究結果對社會群體的利益。CAR-NK細胞療法目前屬于免疫治療癌癥中熱門領域，因此，首先要確保科研團隊受過專業培訓或相關的治療經驗。從事癌癥免疫治療的研究人員和醫務人員應具備相應的研究能力或者取得相關專業資格證書。這些能夠確保在治療過程中對緊急情況采取及時和準確的對策。同時，對科研人員和醫務人員的倫理道德也應制定嚴格的審批與準入標準，以減少治療過程中的不正當利益關聯，最大限度地保障患者的生命健康權。最后應該加大處罰力度，對醫療機構違規開展臨床研究和轉化應用、未按規定開展研究、醫師違反規定、其他醫務人員違反規定、非醫療機構違規開展臨床研究等情形明確處罰措施，包括警告、限期改正、罰款、取消診療科目、吊銷《醫療機構執業許可證》，開除或辭退，終生不得從事生物醫學新技術臨床研究等；情節嚴重的還將追究刑事責任。

3.3 加快CAR-NK細胞療法監管體系建設

2017年，原國家食品藥品監督管理總局發布《細胞治療產品研究與評價技術指導原則(試行)》，對細胞治療產品按照藥品管理相關法規進行研發時的技術要求進行了總體闡述。該指導原則發布以來，我國干細胞治療產品的研發和注冊申報數量明顯增加。2019年4月，國家藥品監督管理局啟動了中國藥品監管科學行動計劃，首批研究項目包括“細胞和基因治療產品技術評價與監管體系研究”，該項目將通過發布一系列技術指南，建設與完善細胞和基因治療產品的技術評價體系。

2020年7月首個技術指南《免疫細胞治療產品臨床試驗技術指導原則(征求意見稿)》發布，意味著國家對免疫細胞治療的認可。而進一步規范免疫細胞治療的臨床研究，是期望能得到更加準確和安全的治療效果。但是，此次出臺的征求意見稿還是一個原則性的文件，希望未來會有進一步的細致條文。如對醫院制備細胞能力的要求，究竟是要求何種條件，何種培養環境，使用何種實驗試劑、耗材等，征求意見稿里并沒有具體明確的細則。由于細胞治療產品的獨特特性，如異質性/復雜性、有限的保質期和穩定性、很少或沒有用于生產的行業標準或參考材料，以及其作用方式的模糊性，與其他生物制品的《藥品生產質量管理規范》(good manufacture practices,GMP)生產相比，其質量更難確定、保證和重現。此外，這些產品很難消除安全風險，因為它們的許多測試方法沒有得到驗證，或者無法用于細胞治療產品的適當評估[16]。因此，建立細胞免疫治療安全性評價體系是保障患者利益的本質要求，安全評估標準應適用于整個治療過程。

不論是雙軌制還是單軌制，最終的目標都應當是用盡可能安全、有效的醫療手段為患者謀福祉。清晰的監管能引導產業有序發展，助推產業釋放潛能。加快完善細胞療法相關制度，可以讓企業少走彎路，節約整個行業的資源，促進監管和審批流程更加科學高效。完善我國的監管制度，既需要借鑒先進國家和地區的理論與經驗，也要考慮本土現實，這既可以促使細胞治療領域良性健康發展，也有利于這一新興療法真正有益于人類的健康。

3.4 提高倫理委員會對CAR-NK細胞療法的審查能力

CAR-NK細胞療法目前尚處于臨床研究階段，其潛在價值和風險仍未完全了解。因此，在進行臨床研究之前，對細胞療法的安全性和有效性進行全面的評估是勢在必行的。我國的一些倫理委員會缺乏必要的實踐經驗和理論知識，倫理委員會在細胞治療相關問題上的培訓體系還不完善[17]，對細胞療法的基本范疇的了解也比較薄弱。因此，倫理委員會應定期邀請細胞療法領域權威專家進行培訓或者參加國內外的學術交流活動等，提升對CAR-NK細胞療法的認知能力；建立考核機制，選取具備該領域倫理審查能力的人員，進而提高對CAR-NK細胞療法倫理審查的專業性；細胞療法的臨床試驗往往是多中心試驗，有必要建立區域倫理委員會，整合和共享區域資源。從而正確、及時地指導和監督細胞治療的研究方案、知情同意和試驗過程。機構倫理委員會應當了解CAR-NK細胞研究過程，從知情同意、NK細胞分離與制備、回輸、患者隨訪及不良反應監測各個環節予以規范和倫理監管。

4 結語

CAR-NK細胞療法逐漸成為癌癥免疫治療領域的熱點之一，同時也取得了多方面的進展，但是仍然有許多技術短板需要克服。盡管與CAR-T 細胞療法相比，CAR-NK細胞療法具有細胞因子風暴發生率低、副作用小的特點，但是仍然需要關注其安全性的問題。對于CAR-NK細胞療法的臨床研究，科研人員應始終秉持嚴謹的科學態度，尊重生命、敬畏生命，保護患者的健康權。國家管理部門應盡快完善相關法律法規、制定CAR-NK細胞療法國家標準操作規程，支持該領域的健康發展。倫理審查相關人員應該深入學習CAR-NK細胞療法的相關知識，全面掌握該領域的法律法規以及技術規范，提升審查能力，確保臨床研究在保護受試者權益的前提下規范開展。