SIRT3-FOXO1介導自噬在H9C2心肌細胞缺血再灌注損傷中的保護作用

王尚徐，林先和

急性心肌梗死（acute myocardial infarction，AMI）是由于心臟冠狀動脈狹窄、閉塞而導致的心肌急性缺血缺氧［1］。急診介入手術可迅速疏通病變的血管，恢復缺血心肌的血氧供應，是目前治療時間窗內AMI的主要治療方法［2］。然而，在血供恢復的同時，缺血部位血流的再灌注也會對心肌細胞造成額外的損傷，稱為心肌缺血再灌注損傷（myocardial ischemia reperfusion injury，MIRI）。MIRI涉及氧化應激、炎癥反應、線粒體功能紊亂和細胞內鈣超載，并可通過細胞凋亡發展為不可逆轉的細胞死亡［3-4］。沉默信息調節因子2相關酶類3（silent mating type information regulator 2 homolog 3，SIRT3）是一種煙酰胺腺嘌呤二核苷酸依賴性去乙酰化酶，為線粒體蛋白去乙酰化的主要調節因子［5］。已有研究發現，在MIRI過程中，SIRT3通過激活AMPK-mTOR、FOXO3a-Pink1-Parkin通路激活自噬，同時也可通過SIRT3-SOD2-mROS通路抑制自噬過程［6］。叉頭盒轉錄因子O1（forkhead box O1，FOXO1）參與細胞氧化應激、凋亡和自噬，并且響應細胞刺激，發揮維持組織穩態的作用［7］。既往研究發現，SIRT3可通過促使FOXO1去乙酰化來誘導自噬，從而改善心肌細胞肥大現象［8］。目前有關SIRT3-FOXO1調控自噬在MIRI過程中發揮作用的研究甚少，本研究在細胞水平構建MIRI模型，旨在探究SIRT3-FOXO1通路在MIRI過程中的作用。

1 材料與方法

1.1 細胞系、主要試劑及儀器 大鼠H9C2心肌細胞及高糖DMEM培養基購自武漢普諾賽公司。慢病毒感染試劑盒購自上海漢恒公司，SIRT3抑制劑3-TYP購自GLPBIO公司，乙酰化FOXO1（Ac-FOXO1）抗體購自賽默飛公司，SIRT3抗體及GAPDH抗體購自Affinity公司，LC3B抗體及Beclin1抗體購自Cell Signaling公司，Bcl-2抗體及Bax抗體分別購自Bioss公司和Abcam公司。逆轉錄及熒光定量PCR試劑盒購自TaKaRa公司。Annexin V-APC∕7-AAD熒光雙染凋亡試劑盒購自Elabscience公司，乳酸脫氫酶（LDH）檢測試劑盒購自日本世諾公司，倒置熒光顯微鏡購自蔡司公司，流式細胞儀及全自動生化儀分別購自貝克曼和日立公司。

1.2 SIRT3穩定過表達細胞株構建及效果驗證 大鼠H9C2心肌細胞培養于含有10%胎牛血清、1%青-鏈霉素的高糖DMEM培養基中，同時準備無糖DMEM培養基（不含胎牛血清及抗生素）用于模擬缺血處理。所有實驗細胞在缺血再灌注干預前均置于普通培養箱（95%空氣，5%CO2，37℃）中培養。選擇生長狀況良好的H9C2心肌細胞，分為SIRT3過表達組和空病毒對照組，分別用帶有SIRT3+綠色熒光蛋白（GFP）基因和只帶GFP基因的病毒，以感染復數（MOI）值=40進行慢病毒感染72 h，嘌呤霉素（1 mg∕L）篩選后獲得SIRT3穩定過表達株。倒置熒光顯微鏡下觀察GFP表達情況。采用qPCR檢測SIRT3過表達效果。Trizol法提取細胞RNA，逆轉錄合成cDNA后進行qPCR反應。SIRT3引物上游5'-GGTCCAGCTAGGGGATGTAGT-3'，下游5'-CCCGCAGGTGAAGAAGTAAG-3'。內參β-actin引物上游5'-CGCGAGTACAACCTTCTTGC-3'，下游5'-CCTTCTGACCCATACCCACC-3'。20μL反應體系包含TB Green Premix Ex TaqⅡ（2×）10μL，上、下游引物（10μmol∕L）各0.8μL，cDNA（50μg∕L）2.0μL，滅菌水6.4μL。反應條件：95℃30 s；95℃5 s，60℃30 s，40個循環。SIRT3 mRNA相對表達水平采用2-ΔΔCt法進行半定量分析。

1.3 體外構建缺血再灌注損傷模型及實驗分組 H9C2細胞設正常對照（NC）組、缺血再灌注（IR）組、SIRT3過表達+缺血再灌注（S+IR）組、SIRT3過表達+IR+SIRT3抑制劑（S+IR+3-TYP）組。NC組細胞置于普通培養箱中添加高糖培養基常規培養。IR組細胞置于缺氧細胞培養箱（1%O2，5%CO2，37℃）中，添加無糖DMEM培養基培養3 h；隨后更換為高糖DMEM培養基，置于普通培養箱中培養24 h。S+IR組將SIRT3過表達的H9C2心肌細胞用無糖DMEM培養基缺氧培養3 h，隨后更換為高糖DMEM培養基，置于普通培養箱中常規培養24 h。S+IR+3-TYP組將SIRT3過表達的H9C2心肌細胞置于含有3-TYP（50μmol∕L）無糖DMEM培養基中，缺氧培養3 h，隨后更換為含3-TYP（50μmol∕L）的高糖DMEM培養基，在95%空氣，5%CO2，37℃條件下培養24 h。

1.4 Western blot法檢測SIRT3、Ac-FOXO1、LC3B、Beclin1、Bax、Bcl-2蛋白表達 將RIPA和PMSF按100∶1比例混合，用于提取各組心肌細胞總蛋白。配制10%的SDS-PAGE分離膠，上樣進行電泳、轉膜、5%脫脂牛奶中封閉2 h。一抗SIRT3、Ac-FOXO1、LC3B、Bax（均為1∶1000稀釋），Beclin1、Bcl-2、GAPDH（均為1∶2000稀釋），4℃孵育過夜，TBST洗膜10 min×3次。二抗（1∶3000）孵育1 h，TBST洗膜后顯影。檢測SIRT3、Ac-FOXO1，自噬標記蛋白LC3B、Beclin1及凋亡相關蛋白Bcl-2、Bax的表達。

1.5 上清液中LDH及細胞凋亡率檢測 收集各組細胞的培養上清液200μL，用全自動生化儀檢測LDH水平。隨后用0.25%胰酶（不含EDTA）消化細胞，收集各組細胞沉淀。采用Annexin V-APC∕7-AAD熒光雙染凋亡試劑盒處理細胞樣本，流式細胞儀檢測細胞凋亡率。

1.6 統計學方法 采用SPSS 25.0和Graphpad Prism 8軟件進行分析，每組實驗最少進行3次。符合正態分布的計量資料以均數±標準差（±s）表示。2組間比較采用獨立樣本t檢驗，多組間比較采用單因素方差分析，組間多重比較采用Tukey檢驗，雙側P＜0.05為差異有統計學意義。

2 結果

2.1 慢病毒感染H9C2心肌細胞的GFP表達及SIRT3過表達情況 慢病毒感染細胞72 h后，倒置熒光顯微鏡下可見SIRT3過表達組大量表達GFP，提示感染成功，見圖1。隨后經qPCR驗證，SIRT3過表達組SIRT3 mRNA相對表達量（3.31±0.13）較空病毒對照組（1.00±0.14）升高（t=16.257，P＜0.01），SIRT3過表達成功。

Fig.1 The GFP expression of H9C2 cells infected with lentivirus(×100)圖1 慢病毒感染H9C2心肌細胞后的GFP表達（×100）

2.2 各組H9C2細胞SIRT3、Ac-FOXO1蛋白表達水平比較 與NC組比較，IR組SIRT3表達降低，而Ac-FOXO1表達升高（P＜0.05）；與IR組比較，S+IR組SIRT3表達升高，而Ac-FOXO1表達降低（P＜0.05）；S+IR+3-TYP組較S+IR組SIRT3表達水平差異無統計學意義（P＞0.05），但Ac-FOXO1表達升高（P＜0.05），見圖2、表1。

Fig.2 Expressions of SIRT3,Ac-FOXO1,LC3B,Beclin1,Bcl-2 and Bax protein detected by Western blot assay in the four groups圖2 Western blot檢測各組細胞SIRT3、Ac-FOXO1、LC3B、Beclin1、Bcl-2、Bax蛋白表達

Tab.1 Comparison of expression levels of SIRT3 and Ac-FOXO1 between the four groups表1 各組細胞SIRT3、Ac-FOXO1蛋白表達水平比較（n=3，±s）

Tab.1 Comparison of expression levels of SIRT3 and Ac-FOXO1 between the four groups表1 各組細胞SIRT3、Ac-FOXO1蛋白表達水平比較（n=3，±s）

**P＜0.01；a與NC組比較，b與IR組比較，c與S+IR組比較，P＜0.05

組別NC組IR組S+IR組S+IR+3-TYP組F SIRT31.15±0.050.80±0.05a 1.06±0.09b 0.99±0.157.974**Ac-FOXO10.60±0.050.75±0.02a 0.60±0.07b 0.76±0.04c 10.080**

2.3 各組細胞自噬標志蛋白和凋亡相關蛋白表達水平比較 與NC組比較，IR組自噬標記蛋白LC3B、Beclin1表達升高，抗凋亡蛋白Bcl-2表達降低，促凋亡蛋白Bax表達升高（均P＜0.05）；與IR組比較，S+IR組LC3B、Beclin1、Bcl-2表達升高，Bax表達降低（均P＜0.05）；與S+IR組比較，S+IR+3-TYP組LC3B、Beclin1、Bcl-2表達降低，Bax表達升高（均P＜0.05），見圖2、表2。

Tab.2 Comparison of expression levels of autophagy marker proteins and apoptosis-related proteins between the four groups表2 各組細胞自噬標志蛋白和凋亡相關蛋白表達水平比較（n=3，±s）

Tab.2 Comparison of expression levels of autophagy marker proteins and apoptosis-related proteins between the four groups表2 各組細胞自噬標志蛋白和凋亡相關蛋白表達水平比較（n=3，±s）

**P＜0.01；a與NC組比較，b與IR組比較，c與S+IR組比較，P＜0.05

組別NC組IR組S+IR組S+IR+3-TYP組F LC3B 0.62±0.030.88±0.10a 1.14±0.04ab 0.88±0.08ac 28.900**Beclin10.79±0.040.95±0.02a 1.27±0.07ab 1.06±0.04ac 63.190**Bcl-21.33±0.060.82±0.06a 1.27±0.04ab 1.07±0.11ac 30.930**Bax 0.80±0.071.04±0.11a 0.74±0.03b 0.93±0.03ac 11.730**

2.4 各組細胞上清液LDH水平及細胞凋亡率的比較 與NC組比較，IR組細胞上清液LDH水平升高，細胞凋亡率升高；與IR組比較，S+IR組上清液LDH水平降低，細胞凋亡率下降；與S+IR組比較，S+IR+3-TYP組上清液LDH水平升高，細胞凋亡率升高（均P＜0.05），見圖3、表3。

3 討論

已有研究證實，SIRT3-FOXO3a、SIRT3-SOD等信號通路的激活可以減輕氧化應激和細胞凋亡，從而改善MIRI［9-10］。同時，SIRT3作為一種重要的去乙酰化酶，可促使FOXO1去乙酰化，增強其轉錄活性，上調Bcl-2等抗凋亡基因的表達［11］。本研究發現，在模擬心肌缺血再灌注過程中，H9C2細胞SIRT3表達下降，細胞中Ac-FOXO1表達增加，細胞凋亡率增加，細胞遭受損傷。過表達SIRT3后，Ac-FOXO1含量減少，抗凋亡蛋白Bcl-2表達增加，促凋亡蛋白Bax表達量和細胞凋亡率降低。然而，使用SIRT3抑制劑3-TYP后，SIRT3表達水平不受影響，但活性受到抑制，乙酰化FOXO1含量增加，細胞凋亡率增加，損傷加重，SIRT3過表達發揮的保護作用被消除。本研究證實SIRT3在心肌缺血再灌注過程中使FOXO1去乙酰化發揮保護作用，與相關文獻報道一致［9-11］。過表達SIRT3基因后，同時伴隨自噬標記蛋白LC3B、Beclin1表達量的進一步增加；但使用SIRT3抑制劑3-TYP后，LC3B、Beclin1表達量下降，提示SIRT3-FOXO1通路在MIRI中的保護作用可能是通過調節自噬水平發揮的。

Fig.3 Apoptosis was detected by flow cytometry in each group圖3 流式細胞術檢測各組細胞凋亡情況

Tab.3 Comparison of LDH level in cell supernatant and apoptosis rate between the four groups表3 各組細胞上清液LDH水平及凋亡率比較（n=3，±s）

Tab.3 Comparison of LDH level in cell supernatant and apoptosis rate between the four groups表3 各組細胞上清液LDH水平及凋亡率比較（n=3，±s）

**P＜0.01；a與NC組比較，b與IR組比較，c與S+IR組比較，P＜0.05

組別NC組IR組S+IR組S+IR+3-TYP組F LDH水平（U∕L）14.00±2.6553.67±3.21a 35.33±2.52ab 50.67±1.53ac 152.000**凋亡率（%）6.61±1.2720.76±1.94a 11.36±0.74ab 20.09±1.58ac 67.650**

細胞自噬是一種保守的細胞分解代謝途徑，當受到外界損傷刺激時，自噬可以將受損的蛋白質乃至某些細胞器進行回收利用，以利于細胞生存［12-13］。FOXO1具有關鍵的轉錄調控活性，在葡萄糖剝奪培養的心肌細胞中，FOXO1被去磷酸化并定位于細胞核，促進自噬通路基因如Atg12的表達［14］。FOXO1去乙酰化可以誘導自噬相關基因的表達，在心肌細胞營養和能量不足的情況下減輕凋亡，發揮保護作用［15］。SIRT3可以與FOXO1結合使其去乙酰化，去乙酰化的FOXO1轉位到細胞核，激活下游的E3泛素連接酶促進自噬的發生，減輕心肌肥厚［8］。自噬與凋亡關系密切，自噬可以抑制應激反應誘發的細胞凋亡，也可以通過抑制凋亡蛋白caspase的激活來阻斷凋亡，發揮保護作用，同時Bcl-2蛋白家族可動態調節凋亡和自噬［16］。本研究結果提示，SIRT3可能通過激活FOXO1去乙酰化促進H9C2心肌細胞自噬的發生，使Bcl-2蛋白的表達增加，Bax蛋白的表達減少，減少H9C2心肌細胞在缺血再灌注損傷中的凋亡。

自噬在心肌缺血再灌注的不同階段發揮不同的作用。在心肌缺血階段，自噬通過降解損傷的蛋白，為蛋白質和糖類的合成提供氨基酸，同時為三羧酸循環提供底物用于合成三磷酸腺苷（ATP），從而保護細胞免于死亡［17］。再灌注階段，自噬水平上調，誘導細胞成分的進行性消耗，從而導致細胞凋亡，過度的激活自噬反而對機體造成損傷。Beclin 1作為自噬的啟動分子，在再灌注階段其表達減少后可引發自噬水平下調，進而減少細胞的凋亡［18］。Wu等［19］研究發現，SIRT3的激活導致Beclin1和LC3Ⅱ∕LC3Ⅰ表達減少，抑制過度線粒體自噬，在缺氧復氧損傷過程中保護H9C2細胞。本研究與上述研究相比，除缺氧復氧時間不同外，在模擬缺血處理的過程時，將高糖培養基更換為無糖培養基，因此實驗結果的不同可能由于造模方法不同。由此可見，SIRT3、FOXO1與自噬在MIRI中的關系仍需要進一步研究，如何減少自噬相關性損傷，發揮其對細胞的保護功能仍是一項難題。

本研究為探究SIRT3-FOXO1通路、MIRI和自噬之間的聯系提供了新的線索，有助于加深對自噬調控的理解，為靶向自噬作為MIRI的新療法提供支持。本研究局限性在于未對FOXO1進行抑制，不排除SIRT3通過其他通路發揮作用，后續將完善相關實驗，并進行動物實驗進一步驗證。