血清Runx2 mRNA表達與尿毒癥患者動脈血管鈣化的關系研究

胡春燕，劉蘭，張東雪，張園，朱榮芳

目前，慢性腎臟病的發病率與病死率呈逐年上升趨勢［1］，而尿毒癥是終末期慢性腎臟病。血管鈣化是尿毒癥患者常見的并發癥，是心血管疾病發病率和死亡率增高的獨立危險因素［［2-3］。因此，尋找尿毒癥患者動脈血管鈣化的危險因素及評估預測方法十分必要。血管鈣化類似于骨的形成，是由于外源性刺激使血管平滑肌細胞發生了表型轉化［4］。Runt相關轉錄因子2（runt-related transcription factor 2，Runx2）是轉錄因子Runt家族成員之一。越來越多的研究顯示Runx2與血管鈣化的發生發展密切相關，在血管鈣化過程中發揮著重要的促進作用［5-6］。但是，目前尚不確定血清Runx2基因表達水平是否對尿毒癥患者動脈血管鈣化有診斷預測價值，因此本研究嘗試探討血清Runx2基因表達在評估尿毒癥患者血管鈣化中的作用，旨在為血管鈣化相關疾病的診斷及預測提供新思路。

1 對象與方法

1.1 研究對象 選取2020年1月—2021年2月于河北醫科大學第四醫院行自體動靜脈內瘺成形術及自體動靜脈內瘺切除重造術的尿毒癥患者78例為研究對象，其中男47例，女31例，平均年齡（55.13±12.08）歲。納入標準：（1）年齡＞18歲。（2）透析時間≥8 h∕周且透析齡≥3個月。排除標準：（1）患有心臟病、腦卒中、多結節性動脈炎、巨細胞動脈炎、系統性紅斑狼瘡者。（2）合并急性感染、嚴重營養不良、惡性腫瘤、血液系統疾病者。（3）合并嚴重肝功能不全、消化及呼吸功能不全者。（4）應用免疫抑制劑、糖皮質激素以及抗癲癇藥物者。（5）臨床資料不全者。根據硝酸銀染色結果進行鈣化評分，并將患者分為鈣化組（n=23）和未鈣化組（n=55）。本研究已通過醫院倫理委員會審核，患者均已簽署知情同意書。

1.2 主要試劑與儀器 PCR引物（中實同創有限公司，中國）、實時熒光定量PCR試劑盒（廣州易錦生物技術有限公司，中國）、Runx2抗體（Abcam公司，英國）、二抗（羅氏，瑞士）。全自動免疫組化儀、化學發光儀（羅氏，瑞士），高速冷凍離心機和實時熒光定量PCR儀（Thermo，美國），分光光度計（EMCLAB公司，德國），全自動血細胞分析儀、全自動生化分析儀（貝克曼庫爾特，美國）。

1.3 研究方法

1.3.1 資料收集 收集患者的一般資料：性別、年齡、透析齡、血壓、心率、原發病?；颊咝袆屿o脈內瘺手術前1 d，抽取清晨空腹8 h的肘正中靜脈血2～4 mL，送本院檢驗中心檢測，包括：血紅蛋白（Hb，庫爾特原理）、透析前血肌酐（Scr，酶法）、葡萄糖（己糖激酶法）、血鈣（偶氮胂Ⅲ法）、血磷（磷鉬酸紫外終點法）、血鈉（電極法）、全段甲狀旁腺素（iPTH，電化學發光法）、白蛋白（溴甲酚綠法）、三酰甘油（酶法）、總膽固醇（酶法）。

在行自體動靜脈內瘺成形術及自體動靜脈內瘺切除重造術時收集患者動脈血管，要求在保證患者手術成功的前提下，取動脈血管切口部位全層動脈血管，盡快放入10%福爾馬林固定24 h，之后進行脫水、浸蠟等處理，最終包埋成蠟塊，可長久保存，需要時進行切片處理。組織玻片進行脫蠟處理后進行后續實驗。

1.3.2 血管硝酸銀染色 將5%硝酸銀滴加到玻片上，紫外光照射1 h，于堿性品紅溶液中復染，顯微鏡下觀察，鈣鹽沉積呈黑色。0分，無鈣鹽沉積；1分，點狀鈣鹽沉積；2分，單個片狀鈣鹽沉積；3分，多個片狀鈣鹽沉積；4分，彌漫性圍繞管腔的鈣鹽沉積［7］。0分為未鈣化組，評分≥1分為鈣化組。

1.3.3 免疫組化測定血管Runx2表達 使用全自動免疫組化染色儀進行染色、修復，呈棕黃色為Runx2陽性。隨機讀取5個高倍視野，依照細胞陽性染色程度評分。1分，弱陽性；2分，中等強度；3分，強陽性。依照陽性細胞數評分為：≤25%為0分，26%～50%為1分，51%～74%為2分，≥75%為3分。陽性細胞和染色強度積分相加為0～6分［8］。

1.3.4 實時熒光定量PCR（qPCR）測定Runx2 mRNA表達水平 提取各組患者血清中的總RNA。利用反轉錄試劑對總RNA進行反轉錄，得到cDNA。引物序列Runx2：上游引物5'-CCCAGTATGAGAGTAGGTGTCC-3'，下游引物5'-GGGTAAGACTGGTCATAGGACC-3'，產物大小149 bp；GAPDH：上游引物5'-GTCTCCTCTGACTTCAACAGCG-3'，下游引物5'-ACCACCCTGTTGCTGTAGCCAA-3'，產 物 大 小131 bp，GAPDH為內參。反應體系20μL，即qPCR Mix 10μL、cDNA 2μL、上游引物2μL、下游引物2μL、補水至20μL，反應條件：95℃變性10 s、60℃退火20 s、72℃延伸10 s，40個循環，采用2-ΔΔCt法計算Runx2 mRNA表達水平。

1.4 統計學方法 采用SPSS 22.0軟件進行數據分析，符合正態分布的計量資料以±s表示，組間比較采用t檢驗；不符合正態分布的計量資料以M（P25，P75）表示，組間比較采用Mann-WhitneyU檢驗。計數資料以例表示，組間比較采用卡方檢驗。相關性分析采用Spearman法。影響因素采用多元線性回歸分析。受試者工作特征（ROC）曲線用于評價Runx2對血管鈣化的診斷預測效能，P＜0.05為差異有統計學意義。

2 結果

2.1 血管組織鈣化及Runx2表達情況 硝酸銀染色結果顯示，鈣化組黑色沉積較未鈣化組顯著增多；免疫組化染色顯示，與未鈣化組相比，鈣化組Runx2棕黃色沉積顯著增多，見圖1。鈣化組鈣化評分為3.0（2.0，4.0）。未鈣化組和鈣化組Runx2評分分別為1.00（0.00，1.00）和3.00（2.00，4.00），鈣化組Runx2評分顯著升高（Z=6.239，P＜0.01）。

Fig.1 Human vascular tissue calcification and Runx2 expression圖1 人血管組織鈣化及Runx2表達情況

2.2 2組患者的臨床指標分析 鈣化組年齡、透析齡、血清Runx2 mRNA水平、血磷、iPTH顯著高于未鈣化組,而血白蛋白和血鈣水平顯著低于未鈣化組（P＜0.05），見表1。

2.3 各臨床指標與患者血管鈣化評分的相關性分析 相關分析結果顯示，血清Runx2 mRNA水平、年齡、透析齡、血磷、iPTH、Runx2評分均與鈣化評分呈正相關（rs分別為0.624、0.310、0.640、0.280、0.400和0.685，均P＜0.05）；血白蛋白和血鈣與鈣化評分呈負相關（rs分別為-0.260和-0.542，均P＜0.01）。

2.4 血管鈣化的多元線性回歸分析 以鈣化評分為因變量，血清Runx2 mRNA水平、年齡、透析齡、血鈣、血磷、白蛋白、iPTH為自變量進行多元線性回歸分析，結果顯示血清Runx2 mRNA表達水平升高、高透析齡和低血鈣是血管鈣化的影響因素（P＜0.05），見表2。

Tab.1 Analysis of clinical indicators of the two groups of patients表1 2組患者的臨床各指標情況分析

Tab.2 Multiple linear regression analysis of vascular calcification表2 血管鈣化的多元線性回歸分析

2.5 血清Runx2 mRNA、透析齡和血鈣對血管鈣化的診斷價值 ROC曲線顯示，血清Runx2 mRNA、透析齡和血鈣三者聯合診斷時的曲線下面積（AUC）為0.934，敏感度為95.65%，特異度為76.36%，見表3、圖2。

Tab.3 Predictive efficacy of serum Runx2 mRNA,serum calcium and dialysis age in the diagnosis of vascular calcification表3 血清Runx2 mRNA、血鈣和透析齡對血管鈣化診斷的預測效能

Fig.2 The ROC curve of serum Runx2 mRNA,blood calcium and dialysis age alone and in combination with the detection of vascular calcification圖2 血清Runx2 mRNA、血鈣和透析齡單獨及聯合預測血管鈣化的ROC曲線圖

3 討論

尿毒癥患者動脈鈣化程度與病死率呈正相關［3］。早發現、早干預，防止血管鈣化的發生發展對于提高尿毒癥患者的生活及生存質量至關重要。尿毒癥患者動脈血管鈣化主要表現為血管中膜鈣化，即動脈中膜的內彈力層出現羥磷灰石晶體鈣的線性沉積，類似于骨的形成［4，9］。尿毒癥患者血管鈣化并非鈣磷被動沉積于血管壁，而是由血管平滑肌細胞介導的可調過程，是由多種調節因素參與調控的類似骨形成的復雜病理過程，主要表現為血管中膜的血管平滑肌細胞由正常的收縮表型向成骨樣表型轉化［10-11］，促進成骨分化相關轉錄因子Runx2等表達增加，進而促進下游一系列骨相關蛋白表達［12］，最終導致鈣磷等礦物質異常沉積于血管壁。

本研究中2組患者的動脈Runx2免疫組化染色顯示，鈣化組血管Runx2表達升高，表明發生鈣化的血管成骨分化相關轉錄因子Runx2表達增加。鈣化組血清Runx2 mRNA水平高于未鈣化組，血清中Runx2表達增加可能誘導動脈中膜層的血管平滑肌細胞鈣化。Patidar等［13］在體外實驗研究中表明，尿毒癥患者血清能夠通過誘導Runx2的表達，進而促進血管平滑肌細胞鈣化，與本研究結果一致。有研究證實，敲低Runx2表達可以抑制血管平滑肌細胞發生表型變化，抑制鈣化的發生，而過表達Runx2會促進血管平滑肌細胞發生表型變化，促進鈣化的發生［14-15］。本研究中血清Runx2 mRNA水平升高是血管鈣化的影響因素，且與鈣化評分呈正相關，提示血清Runx2 mRNA水平升高促進了血管鈣化的發生。ROC曲線結果顯示，血鈣的AUC最小，即血鈣對模型的影響最小。血清Runx2 mRNA、透析齡和血鈣三者聯合時AUC最大，因此血清Runx2 mRNA、透析齡和血鈣水平聯合對血管鈣化具有較高的診斷預測價值。

本研究鈣化組的年齡、透析齡、血磷、iPTH顯著高于未鈣化組,與鈣化評分呈正相關；而血白蛋白和血鈣水平顯著低于未鈣化組，與鈣化評分呈負相關?；貧w分析顯示，高透析齡與低血鈣是血管鈣化的影響因素，與Cozzolino等［16］研究結果一致。高iPTH、高磷血癥、低鈣血癥是尿毒癥患者常見的并發癥，其中高磷血癥是血管鈣化發生的始動因素和中心環節，而隨著年齡增加和透析時間延長，高磷血癥的發生率也增高，可能會誘發血管平滑肌細胞發生表型轉化，增加尿毒癥患者血管鈣化發生的風險［17-19］。所以，糾正高血磷和低血鈣、降低iPTH是臨床預防血管鈣化的主要措施。也有研究證實，高磷可通過鈉依賴性磷酸鹽共轉運蛋白促使血管平滑肌細胞發生表型轉化，進而導致鈣化［20］。有研究表明尿毒癥患者低血白蛋白與高炎癥狀態密切相關，而高炎癥狀態可增加血管鈣化的風險［21］。López-Mejías等［22］研究表明炎性因子白細胞介素-6可誘導血管平滑肌細胞發生表型轉化，進而導致血管鈣化。

本研究為單中心的橫斷面研究，樣本量小，不能排除其他混雜性因素的影響，且研究為RNA水平，故具有一定的局限性。今后需擴大樣本量并增加對Runx2蛋白水平的研究，對本研究的結論進行驗證。

綜上所述，血清Runx2 mRNA水平顯著升高是尿毒癥患者發生血管鈣化的影響因素，其與透析齡、血鈣聯合用于評估時的診斷預測效能更高。血清Runx2 mRNA可能成為診斷預測尿毒癥患者血管鈣化的生物學標志物，為血管鈣化相關疾病的診斷及預測提供新思路。