一種基于體內CTC捕獲的CellCollector?技術對乳腺癌患者分層的價值

王玲艷，高春暉，馮雪園，崔鑫淼，孫建云，何向輝

乳腺癌是女性常見的惡性腫瘤。2015年我國女性乳腺癌新發病例約30.4萬例，占女性全部惡性腫瘤發病的17.1%；死亡病例約7.0萬例，占女性全部惡性腫瘤死亡的8.2%［1］。20%～30%的原發性乳腺癌患者因局部復發或遠處轉移而危及生命［2-3］。循環腫瘤細胞（circulating tumor cell，CTC）指自發或因診療操作由原發灶或轉移灶脫落進入外周血循環的腫瘤細胞。CTC與癌癥遠處轉移有直接關系，是液體活檢重要標志物之一［4-5］，可用于指導治療、監測療效、風險分層以及預測預后［6-8］。傳統的CTC檢測技術由于標本量較少（通常為3～10 mL外周血），以致CTC檢出率較低，一般低于50%［9］。因此，克服外周血標本體積限制對提高CTC捕獲率和檢出率有重要意義［10］。CellCollector?是全球首創的體內CTC檢測技術，已被用于包括乳腺癌在內的多個癌種的臨床診斷。CellCollector?體內CTC檢測技術通過留置針肘靜脈留置30 min，期間過血量約1500 mL，從而大大提高了CTC檢測的敏感度。既往報道在乳腺癌、肺癌等多個癌種中CellCollector?檢出率可達71%［11］。目前，基于CellCollector?技術捕獲CTC在非轉移性乳腺癌中的研究較少。本研究使用CellCollector?技術，分析不同臨床特征乳腺癌患者CTC檢出率的差異，以及CTC動態變化與患者疾病進展的關系，探討其用于篩選轉移風險較高的乳腺癌患者的可能性。

1 對象與方法

1.1 研究對象 選取2018年9月—2020年12月就診于天津醫科大學總醫院經病理檢查確診為原發性乳腺癌的女性患者。納入標準：（1）腫瘤均位于單側。（2）不伴有其他臟器惡性腫瘤及其病史者。排除標準：（1）合并心腎等重要臟器功能不全者。（2）妊娠及哺乳期女性。共納入60例乳腺癌患者為乳腺癌組，年齡30～78歲，平均年齡（50.15±12.05）歲，絕經者32例。其中Ⅰ期16例、Ⅱ期29例、Ⅲ期11例、Ⅳ期4例。根據基線CTC檢出情況將患者分為CTC陽性組和CTC陰性組。另外，納入同期10例健康女性志愿者為對照組，年齡28～72歲，平均年齡（49.60±15.39）歲，絕經者5例。乳腺癌組和對照組年齡（t=0.128）、是否絕經（χ2=0.038）差異均無統計學意義。本研究通過醫學倫理委員會批準，所有受試者均已簽署知情同意書。

1.2 資料收集 收集患者年齡、絕經情況、TNM分期、分子分型、Ki-67表達程度。從第1次診療開始，以電話方式每3個月隨訪1次，了解患者生存狀況，包括疾病進展情況、生存狀態等，隨訪截至2021年4月。

1.3 治療方案 綜合患者病理分期及分子分型，激素受體陽性（HR+）分為Luminal A型和Luminal B型。Luminal A型患者以手術+內分泌治療為主；Luminal B型且人表皮生長因子受體-2（HER-2）陰性患者以手術+化療+內分泌治療為主，Liminal B型且HER-2陽性患者以手術+化療聯合抗HER-2治療+內分泌治療為主；HER-2陽性患者以手術+化療聯合抗HER-2治療為主；三陰性乳腺癌（TNBC）患者以手術+化療為主。

1.4 CellCollector?體內CTC檢測 利用CellCollector?（GILUPI GmbH，Potsdam，Germany）在乳腺癌組乳腺癌根治術或保乳術后進行至少1次外周血CTC檢測，對照組入組后只接受1次CTC檢測。采樣針通過20 G留置針穿刺入肘靜脈，確保涂布有上皮細胞黏附分子（EpCAM）抗體和防止白細胞（WBC）非特異吸附的水凝膠涂層的功能區暴露于外周血中。

CTC采集完成后，將CellCollector?按照染色試劑盒說明書要求進行染色并鑒定，同時設有陰性對照惡性非霍奇金淋巴瘤患者的自然殺傷細胞（NK-92）及陽性對照人乳腺癌細胞（MCF7）。分別通過WBC共同抗原CD45（EXBIO Praha，克隆號MEM-28-Alexa647）抗體、細胞角蛋白CK7∕19∕panCK抗體（EXBIO Praha，克隆號A53-B∕A2-Alexa488）進行染色分析，然后通過Hoechst33342熒光染料（Sigma）進行核染色，同時結合細胞學形態鑒定所捕獲的細胞是否為腫瘤細胞。其中，綠色信號為CK7∕19∕panCK陽性，藍色信號為Hoechst33342陽性，紅色信號為CD45陽性。CTC陽性判讀標準：具有完整細胞形態且CD45-，CK7∕19∕panCK+，Hoechst33342+的細胞。CD45+，CK7∕19∕panCK-，Hoechst33342+則為WBC，見圖1。

1.5 統計學方法 采用SPSS 23.0軟件進行數據分析。符合正態分布的計量數據采用均值±標準差（±s）表示，組間比較采用獨立樣本t檢驗。計數資料以例表示，組間比較采用卡方檢驗或Fisher確切概率法。相關性分析采用Spearman法。P＜0.05為差異有統計學意義。

2 結果

2.1 乳腺癌患者基線CTC檢測情況 乳腺癌組基線CTC檢出率為73.33%（44∕60），范圍1～46個，中位數為2個，26.67%（16∕60）患者CTC數目≥5個。Ⅰ、Ⅱ、Ⅲ和Ⅳ期乳腺癌患者CTC陽性比例分別為43.75%（7∕16）、82.76%（24∕29）、81.82%（9∕11）和100%（4∕4），Ⅰ～Ⅲ期乳腺癌患者CTC檢出率為71.43%（40∕56）。各分期中≥5個CTC的患者所占比例分別為2∕16、9∕29、3∕11、2∕4，各分期患者CTC檢出中位數分別為0個、2個、2個、4個。對照組未檢測到CTC。乳腺癌組患者CTC陽性結果見圖2。

2.2 不同臨床特征患者CTC陽性率比較 乳腺癌患者不同臨床分期下CTC檢出率差異有統計學意義（P＜0.05），不同年齡、是否絕經、不同分子分型及Ki-67表達水平患者CTC檢出率差異均無統計學意義，見表1。

Fig.1 Standard image of CTC detection in CellCollector?(×100)圖1 CellCollector?體內CTC檢測判讀標準圖（×100）

Fig.2 Representative image of CTC positive detection in CellCollector?(×100)圖2 CellCollector?體內CTC檢測陽性結果（×100）

2.3 CTC動態監測結果及與疾病進展情況的相關性分析 24例患者進行2次CTC檢測，其基線CTC檢出率為70.83%（17∕24），CTC數目范圍0～13個，中位數2個，25.00%（6∕24）患者CTC數目≥5個；第2次CTC檢出率為62.50%（15∕24），CTC數目范圍0～9個，中位數1個，8.33%（2∕24）患者CTC數目≥5個。隨訪4～19個月，50.00%（12∕24）患者CTC數目降低，16.67%（4∕24）患者CTC數目升高，33.33%（8∕24）患者CTC數目不變。4例患者疾病發生進展，其基線均檢出CTC，其中1例CTC數目增多，3例CTC數目降低。20例無疾病進展患者中，基線CTC檢出率為65.00%（13∕20），其中45%（9∕20）患者CTC數目降低，40%（8∕20）患者CTC數目不變，15%（3∕20）患者CTC數目升高。Spearman相關性分析得出CTC數目動態變化與疾病進展不存在相關性（rs=-0.224，P＞0.05）。

Tab.1 Comparison of positive CTC rates at baseline between different clinical characteristics表1 不同臨床特征下基線CTC陽性率比較（例）

3 討論

CellCollector?使用EpCAM抗體特異性捕獲CTC，其功能區的水凝膠涂層避免了WBC的非特異性富集，確保了捕獲方法的特異性。相比于CellSearchTM體外檢測技術，CellCollector?可檢測約1500 mL外周血，大大提高了CTC檢出率［6］。一項注冊臨床試驗入組127例轉移性乳腺癌患者和63例良性乳腺疾病患者，采用CellCollector?對所有入組人員進行基線CTC檢測，結果顯示乳腺癌患者CTC檢出率為74.8%，良性組檢出率為0，特異度為100%［12］。此外，CellCollector?的CTC檢測具有安全性、穩 定 性 和 可 重 復 性［11，13］。這 些 優 勢 使 得CellCollector?成為同時通過歐洲聯盟（CE）和中國國家藥品監督管理局（NMPA）批準的CTC體內捕獲和鑒定技術。不論體內還是體外CTC檢測，現有研究多為探究CTC與轉移性乳腺癌患者的關系。Xie等［6］采用CellCollector?檢測38例轉移性乳腺癌患者的CTC，結果顯示CellCollector?檢出率較高，且可以獨立預測預后。本研究通過入組60例Ⅰ～Ⅳ期乳腺癌患者，探究基于CellCollector?檢測的CTC在原發性乳腺癌患者中的應用價值。

本研究中所有患者基線CTC檢出率為73.33%，對照組檢出率為0，表明CellCollector?檢測的CTC敏感度較高，且特異度為100%。本研究分析未發生轉移的乳腺癌患者的CTC檢出率，結果顯示，Ⅰ～Ⅲ期患者中CTC檢出率為71.43%，高于傳統體外CTC檢測技術CellSearchTM檢出率的20%左右［8，10］。有研究發現CTC作為微小殘留病灶可以識別出轉移高風險人群［7，14］。在第8版《AJCC癌癥分期手冊》中，CTC已作為一個新的M分期（遠端轉移）標準被列為M0和M1之間的cM0（i+）分期［15］。Sparano等［7］研究發現，早期乳腺癌中CTC陽性患者較陰性患者相比復發風險高13.1倍，提示CTC輔助臨床對患者進行復發轉移風險分層有重要意義。本研究中Ⅰ～Ⅳ期檢出率差異有統計學意義，這為輔助乳腺癌診斷，從而進行針對性治療提供了新的依據。本研究中不同年齡、是否絕經、分子分型乳腺癌患者CTC檢出率差異無統計學意義，與既往采用體外技術CellSearchTM檢測CTC的研究結果一致［9，14］。Ki-67作為一種細胞增殖的核標志物，是反映腫瘤細胞增殖活性的重要指標［16］。但是，本研究中Ki-67表達＞30%和≤15%乳腺癌患者CTC檢出率的差異無統計學意義，因此需要大樣本量的前瞻性研究來探討驗證兩者的關系。

Schott等［17］研究指出，在治療期間動態監測CTC可以實時評估療效，早期發現治療敏感或耐藥患者。《中國臨床腫瘤學會乳腺癌診療指南2020》也提出，CTC可以動態監測疾病進展和預測預后，這對輔助臨床決策，實現精準化治療具有重要意義。本研究進一步探討了CellCollect?體內技術捕獲的CTC在治療中的動態變化是否可以反映治療效果，但并未發現CTC的動態變化與疾病進展具有相關性。

本研究為單中心的小樣本研究，結果表明CellCollector?體內CTC檢測技術用于Ⅰ～Ⅳ期乳腺癌患者有較高的檢出率，這為CTC用于監測疾病早期進展提供了更多支持。CTC與疾病進展的關系需要大規模的研究來進一步探討分析。