芹菜素對(duì)子宮內(nèi)膜癌HEC-1-B細(xì)胞增殖和凋亡的影響及其機(jī)制研究

陳容，時(shí)艷華

子宮內(nèi)膜癌（endometrial carcinoma，EC）是常見的婦科惡性腫瘤，好發(fā)于圍絕經(jīng)期和絕經(jīng)后女性，EC的發(fā)病率與患者的生活習(xí)慣和區(qū)域密切相關(guān)，呈逐年增高趨勢(shì)［1］。手術(shù)、放化療等傳統(tǒng)的治療手段效果顯著，但會(huì)產(chǎn)生肝腎損傷、胃腸道毒性、月經(jīng)不調(diào)等不良反應(yīng)［2］。目前，中醫(yī)藥治療腫瘤日益受到臨床的關(guān)注，中藥在發(fā)揮多途徑、多靶點(diǎn)治療的同時(shí)，還具備不良反應(yīng)少、機(jī)體耐受性好等優(yōu)勢(shì)［3］。芹菜素是一種天然的黃酮類化合物，目前已證實(shí)其具有抗炎、抗氧化和調(diào)節(jié)免疫等生物活性［4-5］。還能抑制多種惡性腫瘤的發(fā)生發(fā)展，包括乳腺癌［6］、黑色素瘤［7］、多發(fā)性骨髓瘤［8］、肝癌［9］等。然而，芹菜素對(duì)EC生物學(xué)功能的影響鮮見報(bào)道。本研究通過觀察芹菜素對(duì)人子宮內(nèi)膜癌HEC-1-B細(xì)胞增殖、遷移、侵襲及凋亡等生物學(xué)功能的影響，探討其可能的作用機(jī)制。

1 材料與方法

1.1 主要材料 HEC-1-B細(xì)胞購自武漢普諾賽生命科技有限公司。芹菜素購自武漢艾美捷科技有限公司，胎牛血清、RPMI 1640培養(yǎng)基、谷氨酰胺、青霉素-鏈霉素-兩性霉素B購自美國(guó)Gibco公司，Annexin V-FITC∕PI凋亡試劑盒、CCK-8試劑盒購自碧云天生物技術(shù)有限公司，Matrigel基質(zhì)膠購自美國(guó)BD公司，促凋亡蛋白Bax、抗凋亡蛋白Bcl-2以及磷脂酰肌醇3激酶（phosphatidylinositol 3-kinase，PI3K）、磷酸化PI3K（p-PI3K）、蛋白激酶B（AKT Serine∕Threonine Kinase，AKT）、磷酸化AKT（p-AKT）、甘油醛-3-磷酸脫氫酶（GAPDH）一抗及羊抗兔、羊抗鼠二抗購自武漢愛博泰克生物科技有限公司。細(xì)胞培養(yǎng)箱（MCO-18AC）購自日本三洋公司，流式細(xì)胞分析儀（CytoFLEX）購自美國(guó)貝克曼公司，凝膠成像儀（Gel Doc XR）購自美國(guó)伯樂公司，低溫高速冷凍離心機(jī)（H2500R-2）購自湖南湘儀離心機(jī)有限公司。

1.2 細(xì)胞培養(yǎng) HEC-1-B細(xì)胞常規(guī)培養(yǎng)于含10%胎牛血清、1 mmol∕L谷氨酰胺、1%青霉素-鏈霉素-兩性霉素B的RPMI 1640培養(yǎng)基中，置于5%CO2、37℃的細(xì)胞恒溫培養(yǎng)箱中培養(yǎng)。待細(xì)胞生長(zhǎng)至融合度達(dá)到80%～90%時(shí)進(jìn)行傳代處理，取生長(zhǎng)狀態(tài)良好的細(xì)胞用于后續(xù)實(shí)驗(yàn)。

1.3 CCK-8法測(cè)定細(xì)胞增殖能力 取處于對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期的HEC-1-B細(xì)胞，接種到96孔板中，每孔約5×103個(gè)細(xì)胞，待細(xì)胞貼壁生長(zhǎng)穩(wěn)定后進(jìn)行給藥處理。將芹菜素溶于DMSO，配制成50 mmol∕L的母液，實(shí)驗(yàn)組芹菜素濃度分別為0、20、40和80μmol∕L。將母液用培養(yǎng)基稀釋成所需濃度，每個(gè)濃度設(shè)置12個(gè)復(fù)孔，分別在細(xì)胞培養(yǎng)24、48和72 h后每孔加入10μL CCK-8溶液，在培養(yǎng)箱中孵育1～4 h。然后，在450 nm的波長(zhǎng)下測(cè)定各孔的光密度（OD）值，計(jì)算細(xì)胞增殖抑制率。細(xì)胞增殖抑制率（%）=（1-實(shí)驗(yàn)孔OD值∕對(duì)照孔OD值）×100%。

1.4 流式細(xì)胞術(shù)檢測(cè)細(xì)胞凋亡 取對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期的HEC-1-B細(xì)胞，以1×106∕孔接種至6孔板。待細(xì)胞貼壁且生長(zhǎng)穩(wěn)定，向孔中分別加入20、40和80μmol∕L的芹菜素，并設(shè)置空白對(duì)照組。培養(yǎng)24 h后，棄去培養(yǎng)上清液，收集細(xì)胞。按照Annexin V-FITC∕PI凋亡試劑盒操作說明處理細(xì)胞，流式細(xì)胞儀檢測(cè)不同濃度芹菜素處理后HEC-1-B細(xì)胞的凋亡情況。

1.5 Transwell實(shí)驗(yàn)檢測(cè)細(xì)胞的遷移和侵襲能力 取處于生長(zhǎng)對(duì)數(shù)期的HEC-1-B細(xì)胞，用RPMI 1640培養(yǎng)基將細(xì)胞稀釋至5×105個(gè)∕mL，取100μL細(xì)胞懸液加入Transwell小室的上室（其中侵襲實(shí)驗(yàn)預(yù)先在上室中加入100μL基質(zhì)膠，遷移實(shí)驗(yàn)不需要加入基質(zhì)膠），將Transwell小室置于24孔板中，并向下室中加入600μL含20%胎牛血清的RPMI 1640培養(yǎng)基。培養(yǎng)1 h后，用RPMI 1640培養(yǎng)基分別將芹菜素母液稀釋至0、5、10、20μmol∕L，隨后替換下層培養(yǎng)基，繼續(xù)培養(yǎng)24 h后取出Transwell小室。用4%的多聚甲醛在4℃固定15 min，0.1%結(jié)晶紫室溫染色20 min。最后用脫脂棉球輕輕擦去Transwell上室中未發(fā)生侵襲和遷移的細(xì)胞，晾干后在顯微鏡下拍照，并計(jì)算細(xì)胞侵襲和遷移數(shù)量。

1.6 Western blot檢測(cè)芹菜素對(duì)凋亡相關(guān)蛋白和PI3K∕AKT通路蛋白表達(dá)的影響 收集0、20、40、80μmol∕L芹菜素處理后的HEC-1-B細(xì)胞，加入細(xì)胞裂解液于冰上裂解30 min，之后4℃、12000 r∕min離心15 min，吸取上清液。BCA蛋白定量試劑盒進(jìn)行蛋白定量，采用SDS-PAGE電泳分離蛋白，經(jīng)轉(zhuǎn)膜、5%脫脂牛奶封閉、一抗孵育、二抗孵育及顯影等步驟后，用Image J軟件對(duì)目的蛋白條帶進(jìn)行灰度值分析，計(jì)算相對(duì)表達(dá)量。實(shí)驗(yàn)中Bax、Bcl-2、AKT、p-AKT、PI3K、p-PI3K、GAPDH一抗稀釋比例均為1∶1000，二抗稀釋比例均為1∶8000。

1.7 統(tǒng)計(jì)學(xué)方法 所有數(shù)據(jù)采用GraphPad Prism 8.1進(jìn)行統(tǒng)計(jì)學(xué)分析，符合正態(tài)分布的計(jì)量資料以均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)差（±s）表示。2組間均數(shù)比較采用獨(dú)立樣本t檢驗(yàn)，多組間均數(shù)比較采用單因素方差分析，組間多重比較采用Tukey-q檢驗(yàn)。P＜0.05為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 芹菜素對(duì)HEC-1-B細(xì)胞增殖能力的影響 20～80μmol∕L范圍內(nèi)，隨著芹菜素濃度的升高和處理時(shí)間的延長(zhǎng)，芹菜素對(duì)HEC-1-B細(xì)胞增殖的抑制作用越來越明顯，見表1。

Tab.1 Comparison of inhibition rates of cell proliferation after apigenin treatment between three groups表1 芹菜素處理后各組細(xì)胞增殖抑制率比較（n=3，%，±s）

Tab.1 Comparison of inhibition rates of cell proliferation after apigenin treatment between three groups表1 芹菜素處理后各組細(xì)胞增殖抑制率比較（n=3，%，±s）

**P＜0.01；a與20μmol∕L組比較，b與40μmol∕L組比較，P＜0.05；組內(nèi)比較：A與處理24 h比較，B與處理48 h比較

組別20μmol∕L組40μmol∕L組80μmol∕L組F 24 h 16.64±1.0548.71±1.46a 69.11±3.47ab 411.900**48 h 31.45±2.89A 61.87±3.32aA 79.90±0.67abA 271.50**72 h 46.25±5.13AB 70.17±6.44aAB 89.55±0.88abAB 61.720**F 55.030**19.300**70.820**

2.2 4組細(xì)胞凋亡水平比較 0、20、40和80μmol∕L的芹菜素處理HEC-1-B細(xì)胞后，細(xì)胞凋亡率（%）分別為6.21±0.94、13.51±1.69、21.87±1.06、30.24±2.34，隨著芹菜素濃度的升高，細(xì)胞凋亡率逐漸增高（F=125.200，P＜0.05），組間多重比較差異均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.05），見圖1。

2.3 4組細(xì)胞凋亡相關(guān)蛋白表達(dá)水平的變化 0～80μmol∕L范圍內(nèi)，隨著芹菜素濃度的升高，促凋亡蛋白Bax表達(dá)逐漸增高，抗凋亡蛋白Bcl-2表達(dá)逐漸下降。見圖2，表2。

Fig.2 Effects of apigenin on apoptosis related proteins圖2 芹菜素對(duì)凋亡相關(guān)蛋白的影響

Fig.3 Transwell test showed that apigenin inhibited the invasion and migration of HEC-1-B cells(×100)圖3 Transwell實(shí)驗(yàn)驗(yàn)證芹菜素抑制HEC-1-B細(xì)胞的侵襲和遷移（×100）

Tab.2 The expression levels of apoptosis related proteins of HEC-1-B cells in three groups表2 各組HEC-1-B細(xì)胞凋亡相關(guān)蛋白的表達(dá)水平（n=3，±s）

Tab.2 The expression levels of apoptosis related proteins of HEC-1-B cells in three groups表2 各組HEC-1-B細(xì)胞凋亡相關(guān)蛋白的表達(dá)水平（n=3，±s）

**P＜0.01，a與0μmol∕L組比較，b與20μmol∕L組比較，c與40μmol∕L組比較，P＜0.05

組別0μmol∕L組20μmol∕L組40μmol∕L組80μmol∕L組F Bcl-20.48±0.030.34±0.03a 0.22±0.04ab 0.12±0.03abc 65.530**Bax 0.15±0.040.28±0.03a 0.40±0.02ab 0.72±0.03abc 207.900**

2.4 芹菜素抑制HEC-1-B細(xì)胞的遷移和侵襲 經(jīng)0、5、10和20μmol∕L的芹菜素處理后，細(xì)胞的遷移和侵襲數(shù)量逐漸較少，見圖3，表3。

Tab.3 Effects of apigenin at different concentrations on migration and invasion of HEC-1-B cells表3 不同濃度芹菜素處理后HEC-1-B細(xì)胞遷移和侵襲能力比較（n=3，個(gè)∕視野，±s）

Tab.3 Effects of apigenin at different concentrations on migration and invasion of HEC-1-B cells表3 不同濃度芹菜素處理后HEC-1-B細(xì)胞遷移和侵襲能力比較（n=3，個(gè)∕視野，±s）

**P＜0.01，a與0μmol∕L組比較，b與5μmol∕L組比較，c與10μmol∕L組比較，P＜0.05

組別0μmol∕L組5μmol∕L組10μmol∕L組20μmol∕L組F細(xì)胞侵襲81.66±4.9053.15±2.28a 36.33±4.38ab 16.08±3.59abc 169.100**細(xì)胞遷移104.61±6.0785.46±8.73a 48.51±4.66ab 23.28±3.21abc 110.300**

2.5 芹菜素抑制HEC-1-B細(xì)胞內(nèi)PI3K∕AKT信號(hào)通路的激活 40μmol∕L芹菜素處理HEC-1-B細(xì)胞24 h后，與0μmol∕L組相比，p-PI3K和p-AKT的蛋白表達(dá)水平均降低（均P＜0.01）。見圖4，表4。

Fig.4 The expression of PI3K∕AKT pathway proteins detected by Western blot assay圖4 Western blot檢測(cè)芹菜素作用后PI3K∕AKT通路蛋白的表達(dá)變化

Tab.4 The expression levels of PI3K/Akt pathway proteins after treatment with 0μmol/L and 40μmol/L apigenin表4 0μmol/L和40μmol/L芹菜素作用后PI3K/AKT相關(guān)通路蛋白的表達(dá)水平變化 （n=3，±s）

Tab.4 The expression levels of PI3K/Akt pathway proteins after treatment with 0μmol/L and 40μmol/L apigenin表4 0μmol/L和40μmol/L芹菜素作用后PI3K/AKT相關(guān)通路蛋白的表達(dá)水平變化 （n=3，±s）

**P＜0.01

組別0μmol∕L組40μmol∕L組t p-AKT 0.33±0.050.15±0.015.342**AKT 0.48±0.040.46±0.040.612 p-PI3K 0.84±0.050.42±0.0312.510**PI3K 0.67±0.020.72±0.041.936

3 討論

EC是僅次于宮頸癌的女性生殖系統(tǒng)常見的惡性腫瘤，其發(fā)病呈年輕化趨勢(shì)，嚴(yán)重威脅女性的健康［10］。目前臨床上用于治療EC的藥物主要有阿霉素、環(huán)磷酰胺、順鉑或卡鉑等，但以上藥物毒性較大，并且患者久用易出現(xiàn)化療耐藥，使治療失敗的風(fēng)險(xiǎn)大大增加。因此，急需尋找和研發(fā)高效低毒、價(jià)格低廉的可替代藥物。

芹菜素是廣泛存在于果蔬中的天然化合物分子，在抑制腫瘤、炎癥等方面作用顯著［11］。本實(shí)驗(yàn)探索了芹菜素在抑制EC進(jìn)展中的生物學(xué)功能，結(jié)果顯示，芹菜素在體外能夠抑制HEC-1-B細(xì)胞的增殖、遷移、侵襲且促進(jìn)其凋亡，同時(shí)下調(diào)HEC-1-B細(xì)胞內(nèi)p-AKT和p-PI3K蛋白的表達(dá)水平，這些結(jié)果表明芹菜素可能通過抑制PI3K∕AKT信號(hào)通路的激活進(jìn)而抑制HEC-1-B細(xì)胞的增殖、遷移和侵襲，該研究結(jié)果與預(yù)期基本一致。本研究進(jìn)一步豐富了芹菜素的抗腫瘤功能，同時(shí)也為后期芹菜素應(yīng)用于臨床治療EC奠定了一定的理論基礎(chǔ)。

在細(xì)胞受到死亡信號(hào)刺激時(shí)，促凋亡蛋白Bax在蛋白酶的作用下發(fā)生構(gòu)象變化，引起細(xì)胞器功能喪失和促凋亡因子的釋放，最終導(dǎo)致細(xì)胞凋亡，而抗凋亡蛋白Bcl-2則在Bax誘導(dǎo)凋亡過程中對(duì)其功能進(jìn)行抑制［12］。研究表明，20μmol∕L的芹菜素能夠抑制肝癌細(xì)胞Huh7和Hep3B的增殖，促進(jìn)其凋亡［13］，并干擾肝癌細(xì)胞的信號(hào)傳導(dǎo)［14］。10μmol∕L的芹菜素能夠顯著抑制血管內(nèi)皮生長(zhǎng)因子的表達(dá)和腫瘤誘導(dǎo)的血管生成［15］。本研究結(jié)果顯示，在0～80μmol∕L范圍內(nèi)，隨著芹菜素處理濃度的不斷提高，促凋亡蛋白Bax的表達(dá)量逐漸增加，而抗凋亡蛋白的Bcl-2的表達(dá)量不斷降低，說明芹菜素能夠促進(jìn)HEC-1-B細(xì)胞的凋亡。這一作用同樣也體現(xiàn)在肺癌［16］和結(jié)腸癌［17］等腫瘤中，進(jìn)一步證實(shí)了芹菜素的抗腫瘤功能。PI3K∕AKT信號(hào)通路作為細(xì)胞內(nèi)重要的信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)通路，參與多種生物學(xué)過程的調(diào)控。磷酸化的PI3K可以產(chǎn)生第二信使三磷酸肌醇，進(jìn)一步使AKT的氨基酸殘基發(fā)生磷酸化，從而發(fā)揮抑制細(xì)胞凋亡和促進(jìn)細(xì)胞增殖的作用。研究表明，芹菜素能通過PI3K∕AKT信號(hào)通路抑制宮頸癌細(xì)胞的遷移并促進(jìn)其凋亡［18］。筆者推測(cè)在EC中芹菜素可能通過PI3K∕AKT信號(hào)通路發(fā)揮類似作用。進(jìn)一步研究發(fā)現(xiàn)，芹菜素能夠顯著抑制p-PI3K和p-AKT的表達(dá)水平，提示在芹菜素的作用下，PI3K∕AKT信號(hào)通路在一定程度上被阻斷，進(jìn)而導(dǎo)致細(xì)胞增殖抑制，從而促進(jìn)凋亡。

綜上所述，芹菜素能夠抑制HEC-1-B細(xì)胞的增殖、遷移、侵襲，同時(shí)誘導(dǎo)凋亡相關(guān)蛋白表達(dá)并促進(jìn)其凋亡，其機(jī)制可能與芹菜素能夠抑制PI3K∕AKT信號(hào)通路有關(guān)。