鉤藤堿固體脂質納米粒對哮喘小鼠miR-155∕p38 MAPK軸的影響

王盟，帕力姑·買買提力，李慧，呂傳峰

哮喘是一類以可逆氣流阻塞、氣道炎癥反應以及氣道重塑為特征的慢性呼吸系統疾病，但其發病原因并不十分明確［1］。其中，以變應原引起的變應性哮喘最為常見，受環境中的過敏原影響，哮喘發作會激發氣道中淋巴細胞及嗜酸性粒細胞的分泌活性增加，誘導炎癥反應發生并且刺激氣道平滑肌細胞肥大［2-3］。鉤藤是一味可以用于治療心腦血管疾病的傳統中草藥，其有效成分包含鉤藤堿、異鉤藤堿及毛鉤藤堿等多種吲哚生物堿［4］。筆者課題組前期研究發現，鉤藤堿固體脂質納米粒（Rhy-SLN）可以調控絲裂原活化蛋白激酶（mitogen-activated protein kinase，MAPK）信號通路，顯著下調p38 MAPK磷酸化水平，進而緩解小鼠的哮喘［5］。微小RNA-155（microRNA-155，miR-155）是一種p38 MAPK上游非編碼調控基因，在哮喘的病理、生理過程中發揮重要作用［6］。Rhy-SLN能否通過調節miR-155∕p38 MAPK軸以緩解小鼠哮喘鮮見相關報道。因此，本實驗通過觀察Rhy-SLN對小鼠肺組織免疫球蛋白E（IgE）、白細胞介素（IL）-13、α平滑肌肌動蛋白（α-SMA）、膠原蛋白Ⅰ（collagenⅠ）、miR-155及p38 MAPK等的影響，探討Rhy-SLN緩解哮喘的分子機制。

1 材料與方法

1.1 材料（1）實驗動物。SPF級BALB∕c雌性小鼠15只，5周齡，體質量18～24 g，購自北京維通利華實驗動物技術公司，生產許可證號SCXK（京）20160006；飼養于濟寧醫學院動物中心，合格證號：20030011。飼養條件：溫度20～23℃，相對濕度40%～70%，動物自由進食飲水，晝夜節律正常［5］。（2）主要儀器與試劑。Rhy-SLN為濟寧市第一人民醫院實驗室自制；鉤藤堿購自寶雞辰光生物科技有限公司，批號：20190121；卵清蛋白購自美國Sigma公司，批號：A5503；IgE、IL-13酶聯免疫吸附試驗（ELISA）試劑盒均購自杭州聯科生物公司，批號：EK275、EK425；羥脯氨酸測試盒購自南京建成公司，批號：A030-2；α-SMA、collagenⅠ、p38 MAPK、磷酸化p38 MAPK（p-p38 MAPK）及內參β-actin抗體購自萬類生物公 司，批 號：WL02510、WL0088、WL00764、WLP1576、WL01845；倒置顯微鏡購自麥克奧迪公司；HF-90型CO2培養箱購自上海力申公司；AV-1000凝膠成像分析系統購自美國BIO-RAD公司；酶標儀購自BIOTEK公司；熒光顯微鏡購自日本OLYMPUS公司。2×SYBR Green qPCR Master Mix購自武漢塞維爾生物技術有限公司，批號FY16599。

1.2 研究方法

1.2.1 Rhy-SLN的制備 參照文獻［5］，精密稱取處方量的鉤藤堿、脂質、卵磷脂等，制備鉤藤堿固體脂質納米粒，4℃密封保存備用。

1.2.2 動物疾病模型制作與分組 15只BALB∕c小鼠適應性喂養后按照隨機數字表法分為正常對照組、模型組及Rhy-SLN組，每組5只，其中模型組和Rhy-SLN組小鼠在模型誘導的第0、14、28、42天皮下注射卵清蛋白溶液（20μg卵清蛋白+1 mg氫氧化鋁溶于200μL磷酸鹽緩沖溶液中），在模型誘導的第21～42天，各組小鼠進行1%卵清蛋白溶液霧化致敏操作，每次霧化30 min，每周3次，正常對照組給予磷酸鹽緩沖溶液為對照，以小鼠出現口唇發紺、腹肌痙攣、呼吸加快、點頭呼吸或站立不穩等表現為模型制作成功。Rhy-SLN組小鼠每次鼻內卵清蛋白溶液致敏操作前1 h以Rhy-SLN（50 mg∕kg）灌胃；正常對照組和模型組給予等量生理鹽水。最后一次致敏操作24 h后，用過量戊巴比妥鈉（200 mg∕kg）處死小鼠，收集各組小鼠肺組織、肺泡灌洗液、血清。肺組織一部分用4%多聚甲醛溶液固定，另一部分以液氮凍存后轉至-70℃超低溫冰箱保存［6］。

1.2.3 肺泡灌洗液涂片觀察嗜酸性粒細胞的數量 肺泡灌洗液以3500 r∕min離心15 min，棄上清液；取沉渣用生理鹽水重懸，將0.1 mL沉淀物涂抹在載玻片上，顯微鏡（×200）下計數每500個細胞中嗜酸性粒細胞的具體比例，嗜酸性粒細胞的數目=計數的總細胞數×每500個細胞中嗜酸性粒細胞的比例。

1.2.4 肺組織HE染色觀察各組細胞形態變化 取各組小鼠肺組織固定、脫水、包埋、切片、染色、封片后光學顯微鏡（×100）下觀察各組細胞形態學變化。

1.2.5 ELISA法測定IgE、IL-13水平 參照相應的ELISA試劑盒說明書，檢測各組小鼠血清中IgE的水平和肺泡灌洗液中IL-13的水平。

1.2.6 肺組織中羥脯氨酸水平檢測 按照羥脯氨酸測試盒要求檢測各組小鼠肺組織中羥脯氨酸水平。羥脯氨酸水平（μg∕mg濕質量）=（測定吸光度值-空白吸光度值）∕（標準吸光度值-空白吸光度值）×標準管濃度（5 mg∕L）×（水解液總體積（10 mL）∕組織濕質量（50 mg）。

1.2.7 Western blot法檢測肺組織中α-SMA、collagenⅠ、p38 MAPK、p-p38 MAPK水平 取各組大鼠的約1∕3右肺組織，剪碎后加入適量RIPA裂解液，勻漿至充分裂解，BCA法進行蛋白定量得出上樣量。取20μg蛋白加樣，十二烷基硫酸鈉-聚丙烯酰胺凝膠電泳（SDS-PAGE）后轉印，轉印后的PVDF膜加入5%的脫脂奶粉TBST封閉1 h。將膜置于1∶1000稀釋的相應一抗中，4℃冰箱過夜。PBST洗滌后將膜放入辣根過氧化物酶標記的兔抗鼠IgG二抗（1∶2000）孵育1 h。加入ECL化學發光試劑，室溫條件下反應1～2 min，凝膠成像分析系統分析蛋白水平。

1.2.8 熒光定量聚合酶鏈反應（qPCR）檢測肺組織中miR-155mRNA表達 按照說明書提取小鼠肺組織總RNA，反轉錄，根據目的基因序列設計引物。miR-155引物序列：上游5'-TTAATGCTAATTGTGATAGGGGT-3'，下游5'-GCAGGGTCCGAGGTATTC-3'；內 參U6：上 游5'-CTAAAGATTTCCGTGGAGAG-3'，下游5'-TGGTGCAGGGTCCGAGGTAT-3'。采用2-ΔΔCt法對miR-155水平行定量分析。

1.3 統計學方法 采用Graphpad Prism 8.0軟件進行數據分析。符合正態分布的計量資料采用±s表示。多組間均數比較采用單因素方差分析，組間多重比較采用SNK-q法。P＜0.05為差異有統計學意義。

2 結果

2.1 各組肺泡灌洗液中嗜酸性粒細胞數量的比較 正常對照組、Rhy-SLN組和模型組BALF中嗜酸粒細胞數分別為9750±234、28125±321及80500±412，呈依次增加趨勢（n=5，F=5.148×104，P＜0.05）。

2.2 各組小鼠肺組織病理改變情況 正常對照組小鼠外周肺組織可見肺泡壁完整，未見大量炎性細胞浸潤；模型組小鼠肺泡壁增厚，部分區域斷裂，有大量炎性細胞浸潤；Rhy-SLN組小鼠可見較多炎性細胞浸潤，肺泡壁增厚，但病理改變較模型組小鼠明顯好轉，見圖1。

Fig.1 Pathological section of lung tissues(HE staining,×100)圖1 肺組織病理切片（HE染色，×100）

2.3 各組血清IgE和肺泡灌洗液IL-13水平的比較 與正常對照組比較，模型組和Rhy-SLN組血清IgE水平、肺泡灌洗液IL-13水平增高（P＜0.05）；與模型組比較，Rhy-SLN組血清IgE水平、肺泡灌洗液IL-13水平降低（P＜0.05），見表1。

Tab.1 Comparison of expression levels of IgE and IL-13 between the three groups表1 各組小鼠IgE、IL-13水平比較 （n=5，±s）

Tab.1 Comparison of expression levels of IgE and IL-13 between the three groups表1 各組小鼠IgE、IL-13水平比較 （n=5，±s）

**P＜0.01；a與正常對照組比較，b與模型組比較，P＜0.05

組別正常對照組模型組Rhy-SLN組F血清IgE（μg∕L）1340±3453181±851a 2409±654ab 10.110**肺泡灌洗液IL-13（ng∕L）199±25478±64a 298±41ab 46.880**

2.4 各組肺組織中α-SMA、collagenⅠ、羥脯氨酸水平比較 與正常對照組比較，模型組和Rhy-SLN組小鼠肺組織中α-SMA、collagenⅠ、羥脯氨酸水平增高（P＜0.05）；與模型組比較，Rhy-SLN組小鼠肺組織中α-SMA、collagenⅠ、羥脯氨酸的水平降低（P＜0.05），見圖2、表2。

Fig.2 The expression levels ofα-SMA and collagen I protein in lung tissue of mice in the three groups圖2 各組小鼠肺組織中α-SMA和collagenⅠ蛋白的表達

Tab.2 Comparison of the expression levels ofα-SMA,collagen I and hydroxyproline in the lung tissue of mice between the three groups表2 各組小鼠肺組織α-SMA蛋白、collagenⅠ蛋白及羥脯氨酸表達比較 （n=5，±s）

Tab.2 Comparison of the expression levels ofα-SMA,collagen I and hydroxyproline in the lung tissue of mice between the three groups表2 各組小鼠肺組織α-SMA蛋白、collagenⅠ蛋白及羥脯氨酸表達比較 （n=5，±s）

**P＜0.01；a與正常對照組比較，b與模型組比較，P＜0.05

組別正常對照組模型組Rhy-SLN組F α-SMA 0.53±0.051.00±0.12a 0.71±0.11ab 29.090**collagenⅠ1.00±0.133.61±0.18a 2.76±0.21ab 284.600**羥脯氨酸（μg∕mg）0.183±0.0200.456±0.040a 0.326±0.020ab 116.500**

2.5 各組肺組織中miR-155、p-p38 MAPK和p38 MAPK表達水平比較 與正常對照組比較，模型組和Rhy-SLN組小鼠肺組織中p-p38 MAPK蛋白表達水平升高，miR-155基因表達水平降低（P＜0.05）；與模型組比較，Rhy-SLN組小鼠肺組織中p-p38 MAPK蛋白表達水平降低，miR-155基因表達水平升高（P＜0.05），見圖3、表3。

Fig.3 The expression levels of p38 MAPK and p-p38 MAPK protein in lung tissue of mice in the three groups圖3 各組小鼠肺組織中p38 MAPK、p-p38 MAPK蛋白表達

Tab.3 The expression levels of miR-155,p38 MAPK and p-p38 MAPK in the lung tissue of mice in the three groups表3 各組小鼠肺組織miR-155、p-p38 MAPK和p38 MAPK表達 （n=5，±s）

Tab.3 The expression levels of miR-155,p38 MAPK and p-p38 MAPK in the lung tissue of mice in the three groups表3 各組小鼠肺組織miR-155、p-p38 MAPK和p38 MAPK表達 （n=5，±s）

**P＜0.01；a與正常對照組比較，b與模型組比較，P＜0.05

組別正常對照組模型組Rhy-SLN組F miR-155 1.00±0.020.25±0.03a 0.56±0.02ab 1.253×103**p-p38 MAPK 1.00±0.024.66±0.21a 2.78±0.14ab 783.900**p38 MAPK 1.00±0.030.97±0.021.00±0.041.552

3 討論

鉤藤是我國的傳統中藥，鉤藤堿是其主要有效成分，占鉤藤總生物堿的28.9%。現代藥理學證實，鉤藤堿能夠抑制外周血管收縮，同時有抗血小板聚集和抗血栓的作用［7-8］。為了有效解決鉤藤堿水溶性差、生物利用度低的缺點，提高其作用效果，課題組前期對鉤藤堿其進行了劑型修飾，制成Rhy-SLN，結果證實其可緩解小鼠哮喘，抑制小鼠氣道平滑肌細胞的增殖，其機制可能與抑制MAPK信號通路有關［5］。

MAPK信號通路是由細胞外調節蛋白激酶1∕2（extracellular-signal-regulated kinases，ERK1∕2）、應激活化蛋白激酶（c-Jun N-terminal kinase，JNK）、p38 MAPK等組成的一類絲氨酸蛋白激酶家族；MAPK是連接細胞膜表面受體與決定基因表達的重要信號調節酶［9］。其中，p38 MAPK是MAPK家族中的四大亞族之一，是介導細胞炎性反應的主要信號通路蛋白，活化后可將信號傳導至細胞核內，在氣管炎性病變和氣道重塑等病理過程中發揮重要作用，因此，p38 MAPK被認為是治療哮喘的重要靶點之一［10］。miR-155是一類內源性非編碼單鏈RNA，為p38 MAPK的上游調控基因［11］，其可通過MAPK10途徑調控促分裂原活化蛋白激酶3和促分裂原活化蛋白激酶6，從而影響p38 MAPK介導的系列生物活性反應過程，主要參與細胞的生長、分化、增殖及免疫應答等過程［12］。研究表明，哮喘的發生、發展與miR-155的高表達密不可分，敲除miR-155可導致支氣管哮喘的炎性細胞浸潤和黏液分泌明顯減輕［13］。本研究發現，與模型組比較，Rhy-SLN組小鼠血清中IgE、肺泡灌洗液中IL-13以及肺組織中的α-SMA、collagenⅠ、羥脯氨酸水平降低，提示Rhy-SLN可以在一定程度上改善哮喘小鼠氣道炎性反應，緩解哮喘癥狀。歐陽過等［14］研究發現，外泌體miR-155可以抑制p38 MAPK信號通路，影響心腎細胞凋亡。另有研究發現，miR-155可以抑制p38基因的表達，從而抑制子宮內膜癌的生長［15］。本研究結果亦顯示，與模型組比較，Rhy-SLN組小鼠肺組織中pp38 MAPK蛋白表達水平降低，miR-155表達水平升高，提示Rhy-SLN可以調控miR-155∕p38 MAPK軸，進而緩解小鼠的哮喘癥狀。

綜上所述，Rhy-SLN可能通過調節miR-155∕p38 MAPK軸，降低氣道的炎癥反應，進而緩解哮喘小鼠的癥狀，故miR-155∕p38 MAPK軸有望成為哮喘新的治療靶點。然而，本實驗僅從小鼠體內實驗進行了論證，后續將從體外實驗進一步驗證鉤藤堿固體脂質納米粒作用于miR-155∕p38 MAPK軸緩解哮喘的作用機制。