基于NF-κB∕ICAM-1通路探討右美托咪定對子癇前期大鼠的神經(jīng)保護作用

張雷，朱詠儀，趙年章，梁少玲

妊娠期高血壓疾病是臨床上導(dǎo)致孕婦和圍生兒患病率和死亡率增高的主要原因之一，子癇前期（preeclampsia，PE）是妊娠期高血壓疾病最嚴重的狀態(tài)［1］。目前，終止妊娠是治療PE唯一有效的治療措施［2］。PE與母體對妊娠的過度炎癥反應(yīng)密切相關(guān)，重度PE患者全身小血管痙攣性收縮，高血壓、免疫反應(yīng)、手術(shù)應(yīng)激、手術(shù)操作及麻醉等均可誘發(fā)患者的血管內(nèi)皮細胞功能異常，進而導(dǎo)致神經(jīng)系統(tǒng)功能異常［3］。研究表明，核因子-κB（nuclear factor kappa-B，NF-κB）∕細胞間黏附分子-1（intercellular adhesion molecule-1，ICAM-1）信號通路可介導(dǎo)淋巴細胞、血小板黏附到內(nèi)皮細胞，從而引起炎癥級聯(lián)反應(yīng)，加重腦損傷，在早期腦損傷炎癥反應(yīng)中發(fā)揮著重要的作用［4］。右美托咪定（dexmedetomidine，DEX）可減少圍術(shù)期血壓波動，降低PE并發(fā)癥發(fā)生率，具有一定的腦保護作用［5］。然而，其是否基于NF-κB∕ICAM-1通路實現(xiàn)對腦神經(jīng)的保護作用有待進一步探究。本研究通過構(gòu)建PE大鼠模型，探究右美托咪定對PE大鼠的神經(jīng)保護作用。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1 實驗動物 SPF級健康成年雌性SD大鼠50只購自廣東省動物中心，體質(zhì)量220～240 g。大鼠飼養(yǎng)于本院動物房，環(huán)境清潔、安靜，通風良好，溫度25℃，相對濕度50%～60%，自由飲食，嚴格按照《關(guān)于善待實驗動物的指導(dǎo)性意見》進行飼養(yǎng)。

1.1.2 試劑與儀器 DEX購自江蘇恒瑞醫(yī)藥股份有限公司（批號12122501，規(guī)格2 mL∕200μg）；S100B、鐵蛋白、白細胞介素（IL）-1β、腫瘤壞死因子-α（TNF-α）及IL-6酶聯(lián)免疫吸附試驗（ELISA）試劑盒，TUNEL染色試劑盒，TTC染色試劑盒購自南京森貝伽生物科技有限公司；兔源GAPDH、ICAM-1、NF-κB、p-NF-κB一抗購自美國Abcam公司（貨號：ab206386、ab171123、ab218533、ab247871）；BCA標準蛋白試劑盒購自美國Thermo Scientific Piece公司。RM2035輪轉(zhuǎn)切片機（德國Leica公司）；SMZ745光學顯微鏡（日本尼康公司）；-80℃低溫冰箱購自美國Thermo公司；Synergy2多功能酶標儀購自美國Bio Tek公司；1658033小型蛋白垂直電泳轉(zhuǎn)印系統(tǒng)（美國Bio-Rad公司）；GelSMART凝膠成像儀（北京大龍興創(chuàng)實驗儀器有限公司）。

1.2 研究方法

1.2.1 大鼠模型制備及分組給藥 將確定妊娠的50只SD大鼠按隨機數(shù)字表法分為：對照組，模型組，DEX低、中、高劑量組，每組10只。除對照組外，其余孕鼠參照文獻［6］制備PE大鼠模型：于妊娠第10～20天，每日腹腔注射200 mg∕kg的同型半胱氨酸（Hcy，美國Sigma公司），隔日背部皮下注射1 g∕kg的谷氨酸單鈉（MSG，美國Sigma公司）；對照組按照上述方法注射10 mL∕kg體積的生理鹽水。

在妊娠第10～20天，DEX低、中、高劑量組分別腹腔注射7.5、15.0、30.0μg∕kg DEX（給藥時間在Hcy及MSG給藥后2 h），模型組和對照組腹腔注射10 mL∕kg體積的生理鹽水，每日1次，持續(xù)10 d。

1.2.2 行為學缺損評分 末次給藥結(jié)束24 h，參照文獻［7］采用改良神經(jīng)功能缺損評分法對大鼠行為學變化進行雙盲評分。總分18分，分數(shù)越高，其神經(jīng)功能損傷越嚴重。

1.2.3 樣本采集 末次給藥結(jié)束24 h，麻醉大鼠，取每只大鼠的腦脊液（150μL），然后迅速斷頭處死，取出左右海馬組織，分成2部分，一部分固定于4%甲醛溶液中備用，另一部分置于-80℃保存。

1.2.4 腦脊液中S100B、鐵蛋白及腦組織中炎性因子水平檢測 ELISA法檢測腦脊液中S100B和鐵蛋白表達水平，取1.2.3中冷凍海馬組織，勻漿后分離上清液，ELISA法檢測大鼠海馬組織炎性因子IL-1β、TNF-α、IL-6表達水平，嚴格按照說明書操作步驟進行。

1.2.5 TUNEL染色法檢測腦組織細胞凋亡情況 取1.2.3中固定的腦組織，常規(guī)制備石蠟切片，TUNEL試劑盒染色后，在顯微鏡下（×200）觀察細胞凋亡情況，棕黃色細胞為凋亡細胞。Image-Pro Plus 6.0軟件分析每視野下凋亡細胞數(shù)目，根據(jù)公式計算細胞凋亡比例，凋亡比例=凋亡細胞數(shù)目∕總細胞數(shù)目×100%。

1.2.6 Western blot檢測腦組織NF-κB∕ICAM-1通路蛋白表達水平 取1.2.3中冷凍海馬組織，加入裂解液充分裂解，勻漿后，4℃離心20 min，收集上清液，得到蛋白樣品液，利用BCA試劑盒測定總蛋白濃度，煮沸變性后，各組分別取含相同質(zhì)量總蛋白的樣品液上樣，進行SDS-PAGE，分離蛋白，濕轉(zhuǎn)，將全部蛋白轉(zhuǎn)移至PVDF膜上，5%脫脂奶粉室溫封閉2 h，分別加入兔源GAPDH、ICAM-1、NF-κB、p-NF-κB一抗溶液中，4℃孵育過夜，TBST漂洗，加入羊抗兔二抗室溫孵育2 h，TBST再次漂洗，采用增強化學發(fā)光法顯色，將條帶置于凝膠成像儀中拍照，并以Image J軟件分析圖片，得出各蛋白相對表達量。

1.3 統(tǒng)計學方法 采用SPSS 24.0軟件進行統(tǒng)計分析。計量數(shù)據(jù)采用均數(shù)±標準差（±s）表示，多組間比較行單因素方差分析，組間多重比較采用SNK-q檢驗。P＜0.05為差異有統(tǒng)計學意義。

2 結(jié)果

2.1 DEX對大鼠行為學的影響 對照組，模型組，DEX低、中、高劑量組行為學評分（單位：分）分別為0.56±0.18、7.12±1.14、5.15±1.23、3.74±1.24、2.45±0.95，差異有統(tǒng)計學意義（n=10，F(xiàn)=59.528，P＜0.01），與對照組相比，模型組大鼠行為學缺損評分顯著增加（P＜0.05）；與模型組相比，DEX低、中、高劑量組大鼠行為學缺損評分依次降低（P＜0.05）。

2.2 DEX對大鼠腦脊液中S100B和鐵蛋白水平的影響 與對照組相比，模型組大鼠腦脊液中S100B與鐵蛋白表達水平顯著升高（P＜0.05）；與模型組相比，DEX低、中、高劑量組大鼠腦脊液中S100B與鐵蛋白表達水平依次降低（P＜0.05）。見表1。

Tab.1 Comparison of the levels of S100B and ferritin in the cerebrospinal fluid between the five groups of rats表1 各組大鼠腦脊液中S100B和鐵蛋白水平比較（n=10，ng∕L，±s）

Tab.1 Comparison of the levels of S100B and ferritin in the cerebrospinal fluid between the five groups of rats表1 各組大鼠腦脊液中S100B和鐵蛋白水平比較（n=10，ng∕L，±s）

**P＜0.01；a與對照組比較，b與模型組比較，c與DEX低劑量組比較，d與DEX中劑量組比較，P＜0.05

組別對照組模型組DEX低劑量組DEX中劑量組DEX高劑量組F S100B 298.34±12.16445.21±18.64a 413.25±16.22ab 375.38±17.34abc 330.14±15.27bcd 137.838**鐵蛋白1021.66±85.471558.32±108.63a 1426.54±112.39ab 1302.96±98.26abc 1165.24±89.32bcd 45.133**

2.3 DEX對大鼠腦組織細胞凋亡的影響 與對照組（1.07%±0.08%）相比，模型組大鼠腦組織細胞凋亡比例（37.22%±3.11%）顯著增高（P＜0.05），DEX低（29.77%±2.07%）、中（18.56%±1.55%）、高（9.09%±1.14%）劑量組較模型組明顯下降（n=10，F(xiàn)=614.013，P＜0.05），高劑量組細胞凋亡比例最低。見圖1。

2.4 DEX對大鼠腦海馬組織炎性因子的影響 與對照組相比，模型組大鼠腦組織中炎性因子IL-1β、TNF-α、IL-6表達水平顯著上升（P＜0.05）；與模型組相比，DEX低、中、高劑量組大鼠腦組織中炎性因子IL-1β、TNF-α、IL-6表達水平依次下降（P＜0.05）。見表2。

Tab.2 Comparison of the expression levels of inflammatory factors in brain tissues of rats between thefive groups表2 各組大鼠腦組織中炎性因子表達水平比較（n=10，±s）

Tab.2 Comparison of the expression levels of inflammatory factors in brain tissues of rats between thefive groups表2 各組大鼠腦組織中炎性因子表達水平比較（n=10，±s）

**P＜0.01；a與對照組比較，b與模型組比較，c與DEX低劑量組比較，d與DEX中劑量組比較，P＜0.05

組別對照組模型組DEX低劑量組DEX中劑量組DEX高劑量組F IL-1β（ng∕L）210.64±27.25416.82±28.59a 382.88±25.33ab 350.45±26.24abc 315.32±25.85bcd 88.097**TNF-α（μg∕L）1.22±0.252.96±0.63a 2.45±0.34ab 1.95±0.36abc 1.48±0.23bcd 33.081**IL-6（ng∕L）235.36±30.24394.35±28.46a 358.41±27.56ab 316.38±27.61abc 276.72±29.43bcd 48.581**

Fig.1 Comparison of TUNEL staining of rat brain tissue between the five groups(×200)圖1 各組大鼠腦組織TUNEL染色比較（×200）

2.5 DEX對大鼠腦組織NF-κB∕ICAM-1通路蛋白表達的影響 與對照組相比，模型組大鼠腦組織p-NF-κB∕NF-κB、ICAM-1蛋白表達水平顯著上升（P＜0.05）；與模型組相比，DEX低、中、高劑量組大鼠腦組織p-NF-κB∕NF-κB、ICAM-1蛋白表達水平依次下降（P＜0.05）。見圖2、表3。

Fig.2 Western blot detection of NF-κB∕ICAM-1 pathway related protein expression in brain tissue of the five groups圖2 Western blot檢測各組大鼠腦組織NF-κB∕ICAM-1通路相關(guān)蛋白表達

Tab.3 Comparison of protein expression levels of NF-κB/ICAM-1 pathway in brain tissue of rats between the five groups表3 各組大鼠腦組織NF-κB/ICAM-1通路蛋白表達水平比較 （n=10，±s）

Tab.3 Comparison of protein expression levels of NF-κB/ICAM-1 pathway in brain tissue of rats between the five groups表3 各組大鼠腦組織NF-κB/ICAM-1通路蛋白表達水平比較 （n=10，±s）

**P＜0.01；a與對照組比較，b與模型組比較，c與DEX低劑量組比較，d與DEX中劑量組比較，P＜0.05

組別對照組模型組DEX低劑量組DEX中劑量組DEX高劑量組F p-NF-κB∕NF-κB 0.28±0.051.21±0.08a 0.88±0.06ab 0.54±0.04abc 0.32±0.03bcd 520.367**ICAM-1∕GAPDH 0.23±0.041.34±0.09a 1.13±0.08ab 0.68±0.04abc 0.26±0.05bcd 622.203**

3 討論

3.1 DEX對PE腦損傷的影響 臨床上，DEX的神經(jīng)保護作用已得到充分證實，并應(yīng)用于神經(jīng)外科等相關(guān)領(lǐng)域。子癇是妊娠高血壓疾病伴隨神經(jīng)損傷癥狀出現(xiàn)的嚴重并發(fā)癥，會對神經(jīng)系統(tǒng)造成一定損傷，影響患者行為活動。研究表明，PE患者的子癇發(fā)作受到復(fù)雜的腦血管病變、代謝異常和一些細胞因子變化的影響［8］。腦脊液占成年哺乳動物大腦細胞外液的50%，其成分反映了中樞神經(jīng)系統(tǒng)中發(fā)生的生化反應(yīng)［9］。腦脊液中細胞因子的變化可反映腦損傷狀態(tài)。本研究發(fā)現(xiàn)，模型組較對照組大鼠行為學評分顯著增加（屬中度神經(jīng)損傷），腦脊液中S100B與鐵蛋白表達水平顯著升高，說明PE大鼠存在神經(jīng)損傷，也反映了PE大鼠模型制備成功；給予DEX后，DEX低、中、高劑量組較模型組大鼠行為學評分依次下降，腦脊液中S100B與鐵蛋白表達水平依次降低，說明DEX能夠抑制大鼠腦脊液中S100B與鐵蛋白的表達，對神經(jīng)損傷具有改善作用，提示其有減輕PE腦損傷的作用。

3.2 PE損傷機制 全身炎癥反應(yīng)是PE的主要發(fā)病機制，促炎因子與抗炎因子的調(diào)控失衡是PE發(fā)生和發(fā)展的關(guān)鍵［10］。本研究中，模型組大鼠腦組織神經(jīng)細胞凋亡嚴重，且海馬區(qū)炎性因子IL-1β、TNF-α、IL-6表達水平顯著高于對照組，說明PE造成腦組織內(nèi)嚴重的炎癥反應(yīng)，導(dǎo)致上述因子表達失調(diào)，造成神經(jīng)細胞凋亡。給予DEX治療后，低、中、高劑量組較模型組的細胞凋亡數(shù)目大大減少，上述因子表達水平顯著降低，且DEX高劑量組效果最好，說明DEX能減輕PE大鼠腦組織中炎癥反應(yīng)，抑制炎性因子升高，進而抑制腦組織神經(jīng)細胞凋亡，改善PE造成的神經(jīng)功能損傷。

NF-κB為一種序列特異的轉(zhuǎn)錄因子，作為信號傳導(dǎo)中樞，與免疫應(yīng)答、腫瘤發(fā)展、細胞凋亡、胚胎發(fā)育等關(guān)系密切［11］。p-NF-κB在腦損傷時會促進ICAM-1、炎性因子和白細胞介素的表達，共同參與腦損傷后炎癥反應(yīng)，p-NF-κB促進下游ICAM-1的表達，ICAM-1表達升高能夠正反饋調(diào)節(jié)NF-κB，誘導(dǎo)NF-κB活 化，激 活NF-κB∕ICAM-1通 路［12-13］。ICAM-1屬于免疫球蛋白超家族成員，能夠與其配體結(jié)合，從而介導(dǎo)白細胞與內(nèi)皮細胞緊密連接，增加白細胞與內(nèi)皮細胞黏附力，進而白細胞透過血管壁，破壞血管局部微循環(huán)通透性，增加細胞通透性，造成組織水腫，加速白細胞聚集［14］；同時，聚集的白細胞在血管壁處造成微血管梗阻，導(dǎo)致腦血液微循環(huán)障礙，加重腦損傷［15］。Shi等［16］研究發(fā)現(xiàn)，PE大鼠中硫酸鎂發(fā)揮腦神經(jīng)保護作用的靶點為NF-κB∕ICAM-1通路。本研究中，給予DEX治療后，DEX低、中、高劑量組較模型組大鼠腦組織p-NF-κB∕NF-κB蛋白表達水平依次下降，且與血管壁白細胞聚集、腦血液微循環(huán)有關(guān)的細胞因子ICAM-1表達也依次降低，提示DEX可能通過抑制NF-κB∕ICAM-1通路活化，進而抑制PE大鼠腦組織中炎癥反應(yīng)，減輕神經(jīng)損傷程度。

綜上所述，DEX可降低炎性因子水平，減少腦細胞凋亡，進而改善神經(jīng)功能，從而達到治療子癇大鼠的目的。這一過程可能與抑制NF-κB∕ICAM-1通路活化有關(guān)。后續(xù)將使用NF-κB∕ICAM-1通路抑制劑及激活劑進一步驗證。