慢病毒介導NK4過表達對人肺腺癌移植瘤生長的影響

戴婷婷，許婷，俞小衛

國內外統計數據顯示，肺癌仍居惡性腫瘤發病率和死亡率的首位，疾病負擔逐年上升［1-2］。近年來，隨著靶向、免疫等治療方案的不斷更新和改進，肺癌患者的生存狀況有了較大的改觀，但其5年生存率仍居于末位［3］，尋找肺癌治療的新方法是亟待解決的問題。基因治療通過將目的基因轉入體內獲得穩定持久的表達，從而發揮治療作用，有望成為腫瘤治療的熱點［4］。NK4作為一種新型抗腫瘤藥物，不僅可以與肝細胞生長因子（HGF）競爭性結合細胞間質上皮轉換因子（cellular-mesenchymal epithelial transition factor，c-Met），抑制HGF∕c-Met介導的腫瘤細胞的增殖、侵襲和轉移［5］，還可以通過直接抑制血管內皮生長因子（vascular endothelial growth factor，VEGF）和堿性成纖維細胞生長因子（basic fibroblast growth factor，bFGF）而抑制血管生成，在細胞生長調節、腫瘤治療研究中具有重要的意義［6-7］。本研究在前期體外細胞水平的研究基礎上，通過構建穩定的NK4過表達慢病毒載體，以瘤內注射的方式對裸鼠皮下移植瘤進行干預，進一步研究慢病毒載體介導的NK4基因過表達對人肺腺癌移植瘤生長的影響。

1 材料與方法

1.1 材料 人肺腺癌A549細胞株由南京醫科大學附屬常州市第二人民醫院中心實驗室惠贈。RPMI-1640培養基、胎牛血清、胰蛋白酶購自美國Gibco公司。4～5周齡無特定病原體（SPF）級健康雌性BALB∕c裸鼠15只購自江蘇科標醫學檢測有限公司，飼養于24℃、50%濕度，SPF級無菌環境中。重組慢病毒載體LV-NK4及陰性對照載體LV-con由上海吉凱基因化學技術公司構建。細胞裂解液、苯甲基磺酰氟（PMSF）和蛋白濃度測定試劑盒購自江蘇凱基生物技術股份有限公司。抗c-Met、抗CD31以及抗Flag標簽兔抗人單克隆抗體購自艾博抗（上海）貿易有限公司，GAPDH兔抗人單克隆抗體及辣根過氧化物酶（HRP）標記的羊抗兔二抗購自江蘇凱基生物技術股份有限公司；原位缺口末端標記（TUNEL）試劑盒購自武漢賽維爾生物科技有限公司。TRIzol購自Invitrogen公司；逆轉錄試劑盒、實時熒光定量PCR（qPCR）試劑盒購自南京諾唯贊生物科技有限公司；PCR引物由上海生工生物工程股份有限公司設計并合成。臺式低溫離心機、梯度PCR儀購于德國Eppendorf公司，穩壓穩流電泳儀，凝膠圖像分析儀（SH-100）購自美國Bio-Rad公司，qPCR儀購自美國Thermo公司。

1.2 研究方法

1.2.1 細胞培養與動物模型建立 人肺腺癌A549細胞株用含10%胎牛血清的RPMI-1640培養基，置于5%CO2、飽和濕度、37℃恒溫培養箱中培養。待細胞貼壁生長匯合達90%后，使用0.25%胰蛋白酶消化傳代。取對數生長期的A549細胞株，調整細胞懸液至2×107個∕mL，于BALB∕c裸鼠右前肢腋端皮下注射A549腫瘤細胞0.2 mL。注射細胞后定期觀察裸鼠健康狀況。接種后10 d左右，裸鼠皮下開始出現結節，15只均成瘤。

1.2.2 動物分組及干預 待瘤徑達5 mm左右時，采用隨機數字表法將15只裸鼠分為磷酸鹽緩沖液（PBS）組、LV-con組和LV-NK4組，每組5只。采用瘤內注射的方式進行給藥，共注射2次，間隔3 d。PBS組注射25μL PBS，LV-con組、LVNK4組分別注射25μL滴度為6×108TU∕mL的陰性對照慢病毒載體LV-con及重組慢病毒載體LV-NK4。隨后繼續放回飼養籠飼養，觀察腫瘤生長情況及裸鼠生存狀態，腫瘤體積按照公式V=（長徑×短徑×高）π∕6計算。連續觀察4周后，頸椎脫臼法處死裸鼠，小心剝離皮下瘤組織，稱量瘤質量并計算抑瘤率。抑瘤率（%）=［PBS組平均瘤質量-LV-NK4組平均瘤質量（或LV-con組平均瘤質量）］∕PBS組平均瘤質量×100%。將一部分瘤組織和取出的肺組織用10%福爾馬林固定，行石蠟包埋備用。另一部分瘤組織-80℃凍存，備用。

1.2.3 裸鼠皮下移植瘤組織及肺組織HE染色 取腫瘤組織及肺組織蠟塊，低溫處理后以最大面積行3μm厚度切片，HE染色法處理后，在低倍鏡下尋找壞死面積最大區域，隨后在高倍鏡下隨機讀取3個視野進行拍照，觀察腫瘤組織壞死情況。肺組織同樣用HE染色法處理觀察其形態及腫瘤轉移情況。

1.2.4 移植瘤組織免疫組化染色 取瘤組織蠟塊，3μm切片，二甲苯脫蠟，梯度乙醇脫水，按免疫組化SP法步驟對裸鼠皮下瘤組織進行染色，檢測瘤組織中c-Met和CD31表達情況。c-Met陽性表達主要定位在細胞質和細胞膜，陽性信號呈棕黃色。從每組切片的高倍視野下讀取10個不同視野，拍照后應用Image Pro.Plus6.0（IPP6.0）定量分析系統進行分析，計算各組蛋白陽性表達平均光密度（mean optical density，MOD）。CD31染色陽性主要定位在血管內皮細胞的細胞膜和細胞質，陽性染色呈棕黃色。CD31染色的血管呈條索狀或具有明顯的管腔。微血管密度（microvessel density，MVD）計數參照Weidner計數法，即先在低倍鏡下（×40）讀取幾個微血管數量最多的“熱點”區域，在高倍鏡下（×400）計數每一個區域中的微血管數，取其平均值為MVD。

1.2.5 TUNEL染色檢測腫瘤細胞凋亡情況 用脫氧核糖核酸末端轉移酶介導的缺口末端標記（TUNEL）法檢測細胞凋亡，具體操作按試劑盒說明書進行。樣本染色完成后立即在熒光顯微鏡下分析，載玻片注意避光。4'，6-二脒基-2-苯基吲哚（DAPI）能將凋亡和未凋亡的細胞均染成藍色，只在凋亡的細胞核中才有異硫氰酸熒光素（FITC）摻入而定位的綠色熒光。每張切片在高倍視野下（×400）取10個視野，分別計數凋亡細胞數和細胞總數，計算凋亡指數（apoptotic index，AI），AI=凋亡細胞數∕細胞總數×100%。

1.2.6 qPCR檢測瘤體內NK4 mRNA的表達 將瘤組織充分研磨，使用TRIzol液提取總RNA，應用分光光度計測定OD260與OD280比值。取1μg RNA逆轉錄為cDNA，以cDNA為模板配置qPCR反應體系，具體如下：2×AceQ qPCR SYBR Green Master Mix 10μL、上下游引物各0.5μL、cDNA 2μL、ddH2O 7μL。引物序列：NK4上游5'-TCCATGATACCACACGAACACAGC-3'，下游5'-CTTCGTAGCGTACCTCTGGATTGC-3'；內參GAPDH上游5'-GGTGAAGGTCGGTGTGAACG-3'，下游5'-CTCGCTCCTGGAAGATGGTG-3'。qPCR反應步驟：95℃5 min；95℃10 s，60℃30 s，循環40次；95℃15 s，60℃60 s；95℃15 s。采用2-ΔΔCt法計算NK4的相對表達量。

1.2.7 Western blot檢測各組瘤組織NK4的蛋白表達 使用RIPA裂解液提取組織總蛋白，BCA法測定蛋白濃度。將蛋白質量濃度調整至3 g∕L。使用10%SDS-PAGE進行電泳，電泳結束后，將蛋白轉移至PVDF膜。5%脫脂牛奶室溫封閉2 h，TBST洗膜后加入Flag標簽抗體（檢測融合蛋白NK4表達情況）和內參GAPDH兔單克隆抗體（1∶1000）4℃孵育過夜。TBST溶液洗去未結合的抗體，室溫下二抗（1∶2000）孵育2 h，TBST洗滌3次，使用ECL化學發光試劑盒進行顯色反應。將膜移入凝膠成像分析儀中，進行成像分析。

1.3 統計學方法 采用SPSS 20.0軟件分析。數據采用均數±標準差（±s）表示，多組間比較采用單因素方差分析（one-way ANOVA），組間多重比較采用LSD-t法。P＜0.05為差異有統計學意義。

2 結果

2.1 慢病毒介導的NK4過表達對裸鼠皮下移植瘤生長的影響 治療期間，裸鼠一般狀況良好，活動能力可，攝食飲水正常。治療28 d后（即實驗第38天），將裸鼠處死并取出瘤組織，可見LV-NK4組瘤組織表面出現出血、壞死、結痂，且瘤組織較LV-con組和PBS組縮小，見圖1。LV-NK4組裸鼠腫瘤體積及腫瘤質量均較LV-con組和PBS組明顯減小（P＜0.05），而LV-con組和PBS組間差異無統計學意義（P＞0.05），見表1。LV-NK4組抑瘤率為44.51%，LV-con組抑瘤率為10.35%，抑瘤效果明顯。

Tab.1 The volume and weight of the transplanted tumor in the three groups表1 各組裸鼠移植瘤體積及質量 （n=5，±s）

Tab.1 The volume and weight of the transplanted tumor in the three groups表1 各組裸鼠移植瘤體積及質量 （n=5，±s）

*P＜0.05，a與PBS組比較，b與LV-con組比較，P＜0.05

組別PBS組LV-con組LV-NK4組F腫瘤體積（mm3）838.598±390.780812.714±348.967316.166±89.290ab 4.612*腫瘤質量（g）0.7829±0.15100.7018±0.22270.4344±0.1234ab 5.689*

2.2 外源性NK4表達增多對瘤組織的形態及肺部轉移的影響 HE染色結果顯示，裸鼠皮下移植瘤的瘤組織為肺腺癌，LV-NK4組裸鼠的瘤組織中出現大量出血壞死灶，細胞核萎縮、變形及破碎，細胞排列稀疏，腫瘤壞死程度高于LV-con組和PBS組。肺組織HE染色切片顯示，LV-con組和PBS組可見腫瘤轉移灶，LV-NK4組未見明顯轉移灶。見圖2。

Fig.1 Comparison of the growth of transplanted tumors between the three groups of nude mice圖1 各組裸鼠皮下移植瘤生長情況比較

2.3 外源性NK4表達增多對瘤組織c-Met表達及肺腺癌微血管形成的影響 免疫組化染色結果顯示，LV-NK4組c-Met染色程度較LV-con組和PBS組明顯減弱（P＜0.05），而LV-con組和PBS組間無明顯差異；LV-NK4組MVD較LV-con組和PBS組降低（P＜0.05），而LV-con組和PBS組間差異無統計學意義，見圖3、表2。

2.4 外源性NK4表達增多對腫瘤細胞凋亡的影響 TUNEL染色實驗結果顯示，LV-NK4組裸鼠皮下移植瘤組織中凋亡細胞數明顯增加，與LV-con組、PBS組凋亡指數差異有統計學意義（P＜0.05），見表2、圖4。

Tab.2 Comparison of the MOD,MVD,AI and expression levels of NK4 mRNA in tumor tissues between the three groups表2 各組移植瘤組織c-Met表達、MVD、AI和NK4 mRNA表達水平比較 （n=5，±s）

Tab.2 Comparison of the MOD,MVD,AI and expression levels of NK4 mRNA in tumor tissues between the three groups表2 各組移植瘤組織c-Met表達、MVD、AI和NK4 mRNA表達水平比較 （n=5，±s）

**P＜0.01，a與PBS組比較，b與LV-con組比較，P＜0.05

組別PBS組LV-con組LV-NK4組F c-Met（MOD）0.7829±0.15100.7018±0.22270.4344±0.1234ab 42.847**MVD 22.00±5.4018.90±3.4811.20±2.78ab 18.954**凋亡指數（%）9.72±2.6211.96±5.2218.13±4.80ab 9.955**NK4 mRNA 1.00±0.101.37±0.333.30±0.73ab 108.922**

Fig.2 The tumor tissues and lung tissues in each group observed by HE staining圖2 HE染色觀察各組裸鼠瘤組織和肺組織

Fig.3 c-Met and CD31 expression in tumor tissues of each group detected by immunohistochemistry(×400)圖3 免疫組化檢測不同治療組移植瘤組織中c-Met、CD31表達（×400）

2.5 移植瘤組織中NK4 mRNA和蛋白表達情況 qPCR結果顯示，LV-NK4組NK4 mRNA表達量較LV-con組和PBS組明顯增加（P＜0.05），見表2。Western blot檢測結果顯示，外源性NK4在LV-NK4組表達相應蛋白，而LV-con組及PBS組未見NK4蛋白表達，見圖5。

Fig.4 The apoptosis of tumor cells in each group detected by TUNEL(×400)圖4 TUNEL法檢測各組腫瘤細胞凋亡情況（×400）

Fig.5 The expression of NK4 in tumor tissues of each group detected by Western blot assay圖5 Western blot檢測各組移植瘤組織NK4蛋白表達

3 討論

基因治療是將目的基因通過載體遞送至細胞內以達到治療目的，已用于癌癥和多種遺傳性疾病的治療［8-9］。基因治療成功的關鍵是將足量的治療核酸有效載荷導入目標細胞，因此必須考慮給藥載體、給藥方法和靶細胞［10］。本研究使用的慢病毒載體是基于人類免疫缺陷病毒（HIV）設計改造的，可以感染分裂和非分裂細胞，具有較強的轉基因攜帶能力（8 kb），并能長期穩定表達［4］。此外，目前研發設計的慢病毒載體具有“自滅活”特性，降低了遺傳毒性風險［10］。給藥方式的選擇也至關重要。肺部基因治療給藥方式中，靜脈注射往往僅有34%的藥物被遞送至肺部，大多數藥物最終進入了肝臟［11］。霧化吸入時霧化器產生的剪切力也會在很大程度上影響載體的功能，降低治療效果［12］。將攜帶有目的基因的慢病毒載體通過瘤內注射的方式給藥，既提高了局部藥物濃度、減少了對非靶器官的影響，同時又可避免給藥過程中載體功能的受損。本研究通過構建穩定的NK4過表達慢病毒載體，以瘤內注射的方式對裸鼠皮下移植瘤進行干預，結果顯示，NK4基因過表達成功并表達相應蛋白發揮作用，提示慢病毒載體介導的NK4過表達可穩定持久轉染裸鼠體內生長的腫瘤細胞，發揮抗腫瘤作用的同時無嚴重不良反應發生。

NK4最早是由Date等［5］通過水解消化HGF獲得，NK4主要由HGF的α鏈部分組成，包括N端的發夾結構和4個環狀結構，這種結構相似性使得NK4可以與HGF競爭性結合c-Met，抑制HGF∕c-Met通路以及下游的PI3K∕Akt、MAPK以及STAT3等相關通路，最終抑制腫瘤細胞侵襲、轉移和對分子靶向藥物的耐藥性［13-14］。近年來的研究還發現，HGF∕c-Met信號通路在腫瘤可塑性、免疫逃逸和適應性機制發展中也起到關鍵作用［15］。本實驗前期通過細胞水平的研究發現，NK4具有抑制人肺腺癌A549細胞增殖并促進其凋亡的作用，并且可能與下調c-Met基因水平有關［16］。本研究發現，NK4過表達可以促進裸鼠皮下移植瘤組織壞死、細胞凋亡，通過對瘤組織進行c-Met免疫組化染色，發現LV-NK4組c-Met蛋白表達水平受到明顯抑制，與細胞水平實驗結果一致，提示NK4可以通過抑制HGF∕c-Met通路，發揮抗腫瘤作用。

此外，NK4作為血管生成抑制劑，不僅可以通過直接抑制VEGF和bFGF影響血管生成，還可以通過與基底膜聚糖結合，抑制纖連蛋白依賴的內皮細胞擴散，從而起到維持血管穩定的作用［7］。本研究發現，LV-NK4組較PBS組和LV-con組瘤組織MVD明顯降低，血管生成受到抑制，提示NK4還可以通過抑制腫瘤微血管生成影響腫瘤生長。此外，肺組織HE染色切片顯示，LV-con組和PBS組可見腫瘤轉移灶，LV-NK4組未見明顯轉移灶，考慮可能與血管生成減少、腫瘤細胞血管內轉移發生率降低有關，具體機制有待進一步研究。

NK4的治療潛力已在多種腫瘤中得到證實［17-19］，其多重抗腫瘤作用在腫瘤治療方面顯示出優勢及前景。本研究通過瘤內注射LV-NK4，不僅可以將足量的NK4基因有效載荷導入腫瘤細胞，從而提高局部藥物濃度，還可以降低慢病毒載體靶向其他組織和器官的可能性，減少對肝臟、腎臟等非靶器官的影響［20］。

綜上所述，慢病毒介導的NK4過表達可以通過促進裸鼠皮下移植瘤壞死、腫瘤細胞凋亡，抑制c-Met蛋白表達以及微血管的形成，最終抑制腫瘤生長。此外，NK4還可能降低腫瘤細胞血管內轉移發生率，從而抑制肺轉移。