miR-186-5p對冠心病大鼠血管內(nèi)皮細(xì)胞損傷及FGF2∕FGFR1信號通路的影響

張曉蕾，許國瑩，王士珍，陳培，陳珊珊，張凱

冠狀動脈粥樣硬化性心臟病即冠心病（coronary heart disease，CHD）主要由冠狀動脈粥樣硬化斑塊的形成引起，這些斑塊導(dǎo)致冠狀動脈變窄及流向心臟的血流減少［1-2］。目前，CHD仍然是心源性猝死的主要原因［3］。研究發(fā)現(xiàn)，內(nèi)皮細(xì)胞損傷和炎癥可能與冠狀動脈粥樣硬化斑塊的形成有關(guān)［4］。微小RNA（miRNAs，miR）參與內(nèi)皮功能障礙、炎癥、血管生成和動脈粥樣硬化等心血管系統(tǒng)疾病的病理過程。miRNAs是一類長度約為22個核苷酸的內(nèi)源性單鏈非編碼RNA，可通過結(jié)合信使RNA（mRNAs）調(diào)節(jié)目標(biāo)基因的表達(dá)［5］。研究發(fā)現(xiàn)，miRNAs可能與CHD的內(nèi)皮損傷有潛在關(guān)系［6］；急性冠狀動脈綜合征患者血 清 中 微 小RNA-186-5p（miR-186-5p）水 平 升高［7］。目前，有關(guān)miR-186-5p與血管內(nèi)皮損傷關(guān)系的研究鮮見。成纖維細(xì)胞生長因子（fibroblast growth factor，F(xiàn)GF）2屬于FGF多肽家族成員，在內(nèi)皮細(xì)胞的增殖、生長、分化和凋亡中發(fā)揮重要作用。FGF2與FGF受體1（fibroblast growth factor receptor 1，F(xiàn)GFR1）結(jié)合，從而調(diào)節(jié)血管內(nèi)皮細(xì)胞的生理變化［8-9］。研究顯示，miR-186-5p與FGF2具有明顯的靶向關(guān)系［10］。本研究擬通過建立CHD大鼠模型，探究在CHD中miR-186-5p靶向FGF2∕FGFR1信號通路與血管內(nèi)皮細(xì)胞損傷之間的關(guān)系，為揭示CHD病理機(jī)制提供參考。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1 實驗動物 SPF級SD雄性大鼠52只，10周齡，體質(zhì)量250～280 g，購自山東艾萊克生物科技有限公司。動物生產(chǎn)許可證號：SCXK（魯）2019-0007；動物使用許可證號：SYXK（魯）2019-0022；動物質(zhì)量合格證號：L2020054423。所有大鼠均于江蘇護(hù)理職業(yè)學(xué)院醫(yī)學(xué)基礎(chǔ)部動物房中飼養(yǎng)，自然光照，自由飲食、飲水，溫度25℃，相對濕度50%，噪音低于80分貝，保持動物房環(huán)境及鼠籠清潔、透氣。

1.1.2 主要試劑和儀器 miR-186-5p抑制劑、miR-186-5p抑制劑陰性對照（NC）由上海生工生物工程有限公司合成；大鼠血管內(nèi)皮細(xì)胞購自北京北納創(chuàng)聯(lián)生物技術(shù)研究院（批號：BNCC342183）；白細(xì)胞介素（IL）-1β、IL-6、腫瘤壞死因子（TNF）-α酶聯(lián)免疫吸附試驗（ELISA）試劑盒，一氧化氮（NO）、內(nèi)皮素（ET）-1測定試劑盒購自南京建成生物工程研究所（批號分別為H002、H007、H052、A013-2-1及H093）；蘇木素-伊紅（HE）染色試劑盒購自上海碧云天生物科技有限公司（批號：C0105）；兔抗鼠FGF2一抗、FGFR1一抗、β-肌動蛋白（β-actin）一抗及羊抗兔二抗購自美國Thermo Fisher Scientific公司（批號分別為PA5-95284、13-3100、A10335及A32723）；熒光素酶報告基因檢測試劑盒購自美國Abcam公司（批號：ab228530）；Lipofectamine 2000轉(zhuǎn)染試劑盒購自美國Invitrogen公司（批號：11668019）；胎牛血清購自杭州仟諾生物科技有限公司（批號：NFBS-1500A）。小動物超聲成像系統(tǒng)購自加拿大VisualSonics公司（型號：Vevo 3100）；全自動生化分析儀購自深圳邁瑞生物醫(yī)療電子股份有限公司（型號：BS-350S）；石蠟切片機(jī)購自德國Leica公司（型號：RM2255）；顯微鏡購自日本Nikon公司（型號：LV100N）；蛋白凝膠成像儀購自美國ProteinSimple公司（型號：FluorChem E）。

1.2 動物模型制備與分組 取40只大鼠，參照文獻(xiàn)［11］每天飼喂30 g高脂飲食（含10%蛋白粉、2%膽固醇、10%豬油、0.2%丙基硫氧嘧啶、0.5%膽酸鈉和77.3%正常飼料），連續(xù)喂養(yǎng)8周，然后腹腔注射垂體后葉素30 U∕kg，共3 d。采用大鼠冠狀動脈造影方法觀察造模大鼠的冠狀動脈，若觀察到冠狀動脈狹窄，有明顯病變，表明CHD模型建立成功。40只大鼠參與造模，4只未造模成功，造模成功的36只大鼠按照隨機(jī)數(shù)字表法分成模型組、miR-186-5p抑制劑組和miR-186-5p抑制劑NC組，每組12只。將5 nmol miR-186-5p抑制劑或miR-186-5p抑制劑NC溶于250μL生理鹽水中制成溶液，均通過尾靜脈注射，前者注射于miR-186-5p抑制劑組大鼠，后者注射于miR-186-5p抑制劑NC組大鼠，每周2次，連續(xù)4周；模型組大鼠尾靜脈注射250μL生理鹽水，每周2次，連續(xù)4周。另取12只大鼠設(shè)為對照組，該組大鼠前8周飼喂正常飼料，然后腹腔注射等量生理鹽水3 d，再尾靜脈注射250μL生理鹽水，每周2次，連續(xù)4周。

1.3 心功能、血脂、炎性因子及血管內(nèi)皮活性物質(zhì)水平檢測 分組干預(yù)后，采用小動物超聲成像系統(tǒng)測量各組大鼠左心室收縮末期內(nèi)徑和舒張末期內(nèi)徑，計算左心室射血分?jǐn)?shù)（LVEF）和左心室縮短分?jǐn)?shù)（LVFS）。取各組大鼠的頸總動脈血5 mL，3000 r∕min離心10 min取上清液，-20℃條件下保存，全自動生化分析儀檢測總膽固醇（TC）、三酰甘油（TG）、高密度脂蛋白膽固醇（HDL-C）和低密度脂蛋白膽固醇（LDL-C）水平。ELISA試劑盒檢測各組大鼠血清中炎性因子IL-1β、IL-6和TNF-α的水平；相應(yīng)試劑盒檢測血清中血管內(nèi)皮活性物質(zhì)NO、ET-1水平。

1.4 冠狀動脈的分離和病理觀察 每組隨機(jī)數(shù)字表法抽取6只大鼠麻醉固定，暴露心臟，在右心耳處做小切口，將生理鹽水緩慢注入左心室中，直至右心耳小切口流出清亮的液體。10%中性福爾馬林心臟灌注，灌流結(jié)束后，在心底上方仔細(xì)分離冠狀動脈，置于10%中性福爾馬林中固定。取部分冠狀動脈組織脫水透明，石蠟包埋、切片，使用HE染色試劑盒進(jìn)行染色，光學(xué)顯微鏡下（×400）觀察各組大鼠冠狀動脈組織病理學(xué)變化。各組剩余冠狀動脈組織液氮速凍后置于-80℃保存。

1.5 大鼠冠狀動脈組織中FGF2、FGFR1蛋白表達(dá)水平測定 取出-80℃保存的冠狀動脈組織，于液氮條件下研磨，加入裂解液，提取總蛋白，檢測蛋白含量，使用聚丙烯酰胺凝膠電泳分離蛋白，轉(zhuǎn)膜封閉2 h后孵兔抗鼠FGF2、FGFR1、β-actin一抗（稀釋倍數(shù)均1∶1000），4℃過夜，洗膜孵二抗（1∶5000），室溫下放置2 h，洗膜，曝光顯色，凝膠成像系統(tǒng)分析蛋白的相對表達(dá)量，β-actin為內(nèi)參蛋白。

1.6 雙熒光素酶鑒定miR-186-5p與FGF2靶向關(guān)系 利用TargetScan（http:∕∕www.targetscan.org∕）預(yù) 測miR-186-5p與FGF2的關(guān)系以及FGF2-3'-UTR中miR-186-5p的結(jié)合位點。從含有miR-186-5p編碼區(qū)的FGF2-3'-UTR啟動子區(qū)域擴(kuò)增序列，構(gòu)建FGF2-3'-UTR-WT質(zhì)粒，參照質(zhì)粒分離試劑盒說明步驟，構(gòu)建FGF2-3'-UTR-MUT質(zhì)粒，將對數(shù)生長期的大鼠血管內(nèi)皮細(xì)胞接種到96孔板中，細(xì)胞融合達(dá)到70%后，用Lipofectamine 2000轉(zhuǎn)染細(xì)胞，將FGF2-3'-UTR-WT質(zhì)粒與miR-186-5p模擬質(zhì)粒充分混合并共轉(zhuǎn)染到大鼠血管內(nèi)皮細(xì)胞中。同時，將FGF2-3'-UTR-WT+NC（對照組）、FGF2-3'-UTR-MUT+NC和FGF2-3'-UTR-MUT+miR-186-5p模擬物分別轉(zhuǎn)染大鼠血管內(nèi)皮細(xì)胞。孵育6 h后，將大鼠血管內(nèi)皮細(xì)胞與10%胎牛血清培養(yǎng)48 h，雙熒光素酶檢測試劑盒檢測各組細(xì)胞相對熒光素酶活性，實驗重復(fù)3次。

1.7 統(tǒng)計學(xué)方法 采用SPSS 22.0軟件進(jìn)行數(shù)據(jù)分析。符合正態(tài)分布的計量資料以±s表示，多組間比較采用單因素方差分析，組間多重比較采用SNK-q檢驗，P＜0.05為差異有統(tǒng)計學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 各組大鼠心功能指標(biāo)比較 與對照組比較，其余各組LVEF和LVFS均降低（P＜0.05）；與模型組和miR-186-5p抑制劑NC組比較，miR-186-5p抑制劑組LVEF、LVFS升高（P＜0.05）；模型組和miR-186-5p抑制劑NC組LVEF、LVFS差異無統(tǒng)計學(xué)意義（P＞0.05），見表1。

Tab.1 Comparison of LVEF and LVFS results between the four groups of rats表1 各組大鼠LVEF、LVFS結(jié)果比較（n=12，±s）

Tab.1 Comparison of LVEF and LVFS results between the four groups of rats表1 各組大鼠LVEF、LVFS結(jié)果比較（n=12，±s）

**P＜0.01；a與對照組比較，b與模型組比較，c與miR-186-5p抑制劑組比較，P＜0.05

組別對照組模型組miR-186-5p抑制劑組miR-186-5p抑制劑NC組F LVEF 0.8216±0.05310.4573±0.0385a 0.5884±0.0426ab 0.4625±0.0374ac 185.813**LVFS（%）51.46±4.5333.28±3.46a 40.67±4.08ab 35.12±3.67ac 51.286**

2.2 各組大鼠血脂水平比較 與對照組比較，其余各組TC、TG、LDL-C水平均升高，HDL-C水平均降低（P＜0.05）；與模型組和miR-186-5p抑制劑NC組比較，miR-186-5p抑制劑組TC、TG、LDL-C水平降低，而HDL-C水平升高（P＜0.05）；模型組和miR-186-5p抑制劑NC組TC、TG、LDL-C、HDL-C水平差異無統(tǒng)計學(xué)意義（P＞0.05），見表2。

Tab.2 Comparison of serum levels of TC,TG,LDL-C and HDL-C between the four groups of rats表2 各組大鼠血清中TC、TG、LDL-C和HDL-C水平比較（n=12，mmol∕L，±s）

Tab.2 Comparison of serum levels of TC,TG,LDL-C and HDL-C between the four groups of rats表2 各組大鼠血清中TC、TG、LDL-C和HDL-C水平比較（n=12，mmol∕L，±s）

**P＜0.01；a與對照組比較，b與模型組比較，c與miR-186-5p抑制劑組比較，P＜0.05

組別對照組模型組miR-186-5p抑制劑組miR-186-5p抑制劑NC組F TC 1.17±0.213.78±0.69a 2.25±0.43ab TG 1.25±0.372.91±0.61a 1.83±0.29ab LDL-C 0.86±0.263.15±0.59a 1.95±0.34ab HDL-C 2.12±0.351.26±0.22a 1.74±0.26ab 3.69±0.58ac 2.87±0.47ac 3.07±0.51ac 1.29±0.19ac 72.017**39.145**70.847**29.231**

2.3 各組大鼠炎性因子水平比較 與對照組比較，其余各組IL-1β、IL-6、TNF-α水平均升高（P＜0.05）；與模型組和miR-186-5p抑制劑NC組比較，miR-186-5p抑制劑組IL-1β、IL-6、TNF-α水平降低（P＜0.05）；模型組和miR-186-5p抑制劑NC組各炎性因子水平差異均無統(tǒng)計學(xué)意義（P＞0.05），見表3。

2.4 各組大鼠血管內(nèi)皮活性物質(zhì)水平的比較 與對照組比較，其余各組ET-1水平升高，NO水平降低（P＜0.05）；與模型組和miR-186-5p抑制劑NC組比較，miR-186-5p抑制劑組ET-1水平降低，NO水平升高（P＜0.05）。模型組和miR-186-5p抑制劑NC組ET-1和NO差異無統(tǒng)計學(xué)意義（P＞0.05），見表4。

Tab.3 Comparison of serum levels of IL-1β,IL-6 and TNF-αbetween the four groups of rats表3 各組大鼠血清中IL-1β、IL-6和TNF-α水平的比較（n=12，ng∕L，±s）

Tab.3 Comparison of serum levels of IL-1β,IL-6 and TNF-αbetween the four groups of rats表3 各組大鼠血清中IL-1β、IL-6和TNF-α水平的比較（n=12，ng∕L，±s）

**P＜0.01；a與對照組比較，b與模型組比較，c與miR-186-5p抑制劑組比較，P＜0.05

組別對照組模型組miR-186-5p抑制劑組miR-186-5p抑制劑NC組F IL-1β 8.86±0.7217.57±1.59a 12.83±1.13ab 17.18±1.94ac 100.106**IL-614.48±0.9747.25±1.53a 30.41±1.28ab 46.97±2.15ac 1232.832**TNF-α 32.19±2.0456.31±3.18a 43.82±1.54ab 55.83±2.67ac 265.217**

Tab.4 Comparison of serum levels of ET-1 and NO between the four groups of rats表4 各組大鼠ET-1和NO水平的比較（n=12，±s）

Tab.4 Comparison of serum levels of ET-1 and NO between the four groups of rats表4 各組大鼠ET-1和NO水平的比較（n=12，±s）

**P＜0.01；a與對照組比較，b與模型組比較，c與miR-186-5p抑制劑組比較，P＜0.05

組別對照組模型組miR-186-5p抑制劑組miR-186-5p抑制劑NC組F ET-1（ng∕L）4.32±0.8712.27±1.84a 7.35±1.59ab 11.63±2.23ac 57.974**NO（μmol∕L）43.86±2.6729.97±2.19a 39.37±1.41ab 30.58±1.53ac 136.692**

2.5 各組冠狀動脈血管組織病理變化的比較 對照組大鼠冠狀動脈血管管壁形態(tài)均勻，內(nèi)皮細(xì)胞排列有序，無炎性細(xì)胞浸潤；模型組冠狀動脈內(nèi)皮細(xì)胞排列紊亂，部分內(nèi)膜脫落，炎性細(xì)胞浸潤明顯；miR-186-5p抑制劑組較模型組病理變化程度減輕，冠狀動脈血管內(nèi)皮細(xì)胞排列較為有序，炎性細(xì)胞浸潤減少；miR-186-5p抑制劑NC組和模型組的病理變化一致，見圖1。

Fig.1 Histopathology of coronary arteries of rats in each group(HE staining,×400)圖1 各組大鼠冠狀動脈組織病理圖（HE染色，×400）

2.6 各組冠狀動脈組織中FGF2、FGFR1蛋白相對表達(dá)水平比較 與對照組比較，模型組和miR-186-5p抑制劑NC組FGF2、FGFR1蛋白相對表達(dá)水平降低（P＜0.05）；與模型組和miR-186-5p抑制劑NC組比較，miR-186-5p抑制劑組FGF2、FGFR1蛋白相對表達(dá)水平升高（P＜0.05）。模型組和miR-186-5p抑制劑NC組FGF2、FGFR1蛋白相對表達(dá)水平差異無統(tǒng)計學(xué)意義（P＞0.05），見圖2、表5。

Fig.2 Western blot assay of FGF2 and FGFR1 in the coronary artery tissues of rats in each group圖2 各組大鼠冠狀動脈組織FGF2、FGFR1蛋白印跡圖

Tab.5 Comparison of FGF2 and FGFR1 protein expression levels in coronary artery tissues between the four groups rats表5 各組冠狀動脈組織中FGF2、FGFR1蛋白表達(dá)水平的比較 （n=6，±s）

Tab.5 Comparison of FGF2 and FGFR1 protein expression levels in coronary artery tissues between the four groups rats表5 各組冠狀動脈組織中FGF2、FGFR1蛋白表達(dá)水平的比較 （n=6，±s）

**P＜0.01；a與對照組比較，b與模型組比較，c與miR-186-5p抑制劑組比較，P＜0.05

組別對照組模型組miR-186-5p抑制劑組miR-186-5p抑制劑NC組F FGF21.25±0.210.55±0.11a 1.08±0.18b 0.60±0.09ac 30.097**FGFR11.05±0.130.14±0.07a 0.61±0.10ab 0.20±0.09ac 107.108**

2.7 miR-186-5p與FGF2靶向關(guān)系的預(yù)測與驗證 生物信息學(xué)預(yù)測結(jié)果顯示，F(xiàn)GF2-3'-UTR序列上存在miR-186-5p連續(xù)的結(jié)合位點，見圖3。FGF2-3'-UTR-WT+NC組、FGF2-3'-UTR-WT+miR-186-5p mimics組、FGF2-3'-UTR-MUT+NC組和FGF2-3'-UTR-MUT+miR-186-5p mimics組的相對熒光素酶活性分別為1.18±0.15、0.57±0.08、1.11±0.10、1.03±0.08（n=9，F(xiàn)=80.274，P＜0.05），其 中 與FGF2-3'-UTR-WT+NC組比較，F(xiàn)GF2-3'-UTRWT+miR-186-5p mimics組相對熒光素酶活性降低，F(xiàn)GF2-3'-UTR-MUT+NC組和FGF2-3'-UTR-MUT+miR-186-5p mimics組相對熒光素酶活性差異無統(tǒng)計學(xué)意義。

Fig.3 Bioinformatics predicts the binding site of miR-186-5p and FGF2-3'-UTR圖3 生物信息學(xué)預(yù)測miR-186-5p與FGF2-3'-UTR結(jié)合位點

3 討論

CHD患者常出現(xiàn)動脈內(nèi)膜層增厚的粥樣硬化斑塊［12］。高血壓、肥胖癥和糖尿病為CHD進(jìn)展的危險因素，對這些并發(fā)癥進(jìn)行治療可降低CHD的死亡率［13］。以小的非編碼RNA為特征的miRNAs在RNA沉默中起著主導(dǎo)作用已成為共識。本研究通過高脂飲食喂養(yǎng)和垂體后葉素注射建立大鼠CHD模型，與對照組比較，模型組TC、TG、LDL-C水平升高，HDL-C水平降低，表明CHD大鼠的血脂水平升高，而高血脂可增加CHD的發(fā)生概率。榮媛等［14］研究認(rèn)為，降低TC、TG和LDL-C水平可有效治療動脈粥樣硬化。本研究結(jié)果顯示，CHD大鼠在miR-186-5p抑制劑的作用下，病理變化程度減輕，冠狀動脈內(nèi)皮細(xì)胞排列較為有序，炎性細(xì)胞浸潤減少，LVEF、LVFS、HDL-C升高，TC、TG、LDL-C降低，表明miR-186-5p可減輕CHD的癥狀，提示miR-186-5p有望成為CHD治療過程中的重要靶點。

全身炎癥是CHD的重要病理生理因素。研究顯示，肝臟產(chǎn)生的C反應(yīng)蛋白（CRP）是對各種炎癥細(xì)胞因子，如巨噬細(xì)胞集落刺激因子（MCSF）、IL-1β、單核細(xì)胞趨化蛋白-1（MCP-1）、TNF-α和IL-18等的反應(yīng)，促發(fā)血管內(nèi)皮炎癥反應(yīng)，進(jìn)而促進(jìn)斑塊形成［15］。本研究結(jié)果顯示，與對照組比較，模型組大鼠血清中炎性細(xì)胞因子IL-1β、IL-6、TNF-α水平升高，而miR-186-5p抑制劑組大鼠IL-1β、IL-6、TNF-α水平較模型組降低，表明miR-186-5p抑制劑可減輕CHD大鼠的炎性反應(yīng)。在動脈粥樣硬化的發(fā)展過程中，IL-1β、IL-6、TNF-α等促炎因子起多種作用。因此，結(jié)合上述研究結(jié)果，筆者推測miR-186-5p抑制劑通過降低促炎因子水平而減輕動脈粥樣硬化。

炎癥反應(yīng)和血管內(nèi)皮細(xì)胞損傷關(guān)系密切，而血管內(nèi)皮細(xì)胞損傷是CHD和動脈粥樣硬化的顯著特征［16］。血管內(nèi)皮細(xì)胞損傷后，炎性因子和血管內(nèi)皮活性物質(zhì)的分泌過程發(fā)生紊亂［17］。本研究結(jié)果顯示，模型組較對照組大鼠血清中ET-1水平升高，NO水平降低，表明CHD大鼠血管內(nèi)皮受到明顯的損傷，而在miR-186-5p抑制劑作用下明顯逆轉(zhuǎn)了ET-1和NO的水平變化，表明miR-186-5p抑制劑可改善大鼠血管內(nèi)皮損傷。

FGF2是成纖維細(xì)胞生長因子家族的重要蛋白質(zhì)。FGF2通過與FGFR1結(jié)合而激活，調(diào)節(jié)細(xì)胞的分化和增殖，在炎癥反應(yīng)中發(fā)揮重要作用［18］。FGFR1對FGF2具有高度親和力，主要負(fù)責(zé)內(nèi)皮細(xì)胞的信號傳導(dǎo)，可直接影響血管內(nèi)皮細(xì)胞的生長、遷移和血管生成等。Yu等［19］體外細(xì)胞研究發(fā)現(xiàn)，通過刺激人軟骨細(xì)胞中FGF2的表達(dá)，進(jìn)而可促進(jìn)人微血管內(nèi)皮細(xì)胞的血管生成活性。miR-186-5p可通過下調(diào)FGF2的表達(dá)，抑制多形性膠質(zhì)母細(xì)胞瘤的發(fā)生［10］。本研究中雙熒光素酶報告實驗結(jié)果證實，miR-186-5p與FGF2具有明顯的靶向關(guān)系；與對照組相比，模型組大鼠冠狀動脈組織中FGF2、FGFR1蛋白相對表達(dá)水平降低，miR-186-5p抑制劑組大鼠FGF2、FGFR1蛋白表達(dá)水平較模型組和miR-186-5p抑制劑NC組升高，表明抑制miR-186-5p水平可上調(diào)FGF2、FGFR1表達(dá)，提示miR-186-5p抑制劑可通過激活FGF2、FGFR1蛋白表達(dá)，從而增強CHD大鼠血管內(nèi)皮細(xì)胞的活性。

綜上所述，miR-186-5p下調(diào)可減輕CHD大鼠的炎癥反應(yīng)和血管內(nèi)皮損傷，并激活FGF2、FGFR1蛋白表達(dá)，但miR-186-5p在CHD中的作用是否還涉及其他機(jī)制，仍需進(jìn)一步研究。