淺析馬鈴薯脫毒試管苗污染防控對(duì)策

次旦卓瑪

(西藏日喀則市農(nóng)業(yè)科學(xué)研究所，西藏 日喀則 857000)

馬鈴薯是很多人喜愛的一種食物，不僅營(yíng)養(yǎng)價(jià)值豐富，而且有抗衰老、減肥、防脫發(fā)等諸多功效。越來越多的人都喜歡這一健康食物，因此，馬鈴薯的市場(chǎng)發(fā)展前景巨大，我國(guó)也將其列為中國(guó)第5大糧食作物。西藏農(nóng)業(yè)產(chǎn)業(yè)中馬鈴薯成為重點(diǎn)發(fā)展產(chǎn)業(yè)，成為幫助當(dāng)?shù)孛癖娒撠氈赂坏闹饕a(chǎn)業(yè)。近年來西藏地區(qū)主要將脫毒種薯繁育與質(zhì)控管理作為工作重點(diǎn)，但在馬鈴薯脫毒試管苗規(guī)模化快繁研究中經(jīng)常出現(xiàn)脫毒試管苗受污染問題，極大影響到馬鈴薯原種生產(chǎn)成本與生產(chǎn)品質(zhì)。為此，如何防范馬鈴薯脫毒試管苗污染，提高快繁效率，成為當(dāng)前馬鈴薯生產(chǎn)亟待解決的一個(gè)重要問題。

1 關(guān)于脫毒馬鈴薯的概述

所謂脫毒種薯就是利用一系列技術(shù)將馬鈴薯種薯內(nèi)的病毒清除掉，得到健康無病毒或極少帶病毒的種薯[1]。脫毒種薯不僅品質(zhì)優(yōu)良、早熟，而且高產(chǎn)。種薯與馬鈴薯的產(chǎn)量與品質(zhì)有著緊密的聯(lián)系。如果種薯質(zhì)量差，則馬鈴薯產(chǎn)量與品質(zhì)將明顯下降，馬鈴薯植株與塊莖遭到病毒侵入，將導(dǎo)致其迅速退化，表現(xiàn)出多種病癥，從而造成馬鈴薯嚴(yán)重減產(chǎn)。為此，要借助相關(guān)物理、化學(xué)、生物方面的技術(shù)盡量清除薯塊中所存在的病毒，獲得安全、無毒的種薯。目前，研究發(fā)現(xiàn)，導(dǎo)致馬鈴薯退化的病毒有30多種，對(duì)馬鈴薯危害最嚴(yán)重的有6種，包括馬鈴薯卷葉病毒(PLRV)、馬鈴薯Y病毒(PVY)、馬鈴薯X病毒(PVX)、馬鈴薯A病毒(PVA)、馬鈴薯S病毒(PVS)及馬鈴薯紡錘塊莖類病毒(PSTVd)。根據(jù)馬鈴薯種植實(shí)踐經(jīng)驗(yàn)發(fā)現(xiàn)，葉片卷曲皺縮、顏色不均，莖稈矮小細(xì)弱，塊莖變形龜裂，產(chǎn)量呈下降趨勢(shì)，說明馬鈴薯已出現(xiàn)“退化”。病毒感染是造成種薯“退化”的重要原因，病毒會(huì)逐漸在薯塊內(nèi)部積累，造成產(chǎn)量下降，馬鈴薯品質(zhì)變差[2]。在病毒的不斷侵染與累積影響下，作為下一代“種子”的薯塊無法自行清除體內(nèi)的病毒，從而使病毒侵染逐年加重。這將阻礙馬鈴薯植株充分發(fā)揮自身品種的優(yōu)勢(shì)，導(dǎo)致大幅減產(chǎn)。通過借助生物技術(shù)清除種薯內(nèi)部病毒，使其相關(guān)生理功能與生產(chǎn)特性得到恢復(fù)，才能防范馬鈴薯發(fā)生退化，從而確保馬鈴薯獲得最佳的商品性狀與產(chǎn)量。這正是種薯脫毒的原因，也是脫毒馬鈴薯能夠促進(jìn)增產(chǎn)增收的主要原因。

2 脫毒馬鈴薯試管苗快繁過程中的污染病變及表現(xiàn)

馬鈴薯脫毒試管苗快繁研究中主要會(huì)采用組織培養(yǎng)技術(shù)，而難免會(huì)存在試管苗污染問題。其中，污染病原大多數(shù)是細(xì)菌與真菌2類。細(xì)菌污染一般在接種24～48h就會(huì)出現(xiàn)，通常可見培養(yǎng)基或材料表面存在黃色或乳白色黏液狀物體，菌落有渾濁的水跡狀，有時(shí)可見菌落呈泡沫發(fā)酵狀。真菌污染則表現(xiàn)癥狀出現(xiàn)較為遲緩，通常在接種5～10d才可見癥狀。當(dāng)剛發(fā)生污染時(shí)可見到霧斑，呈針狀，之后會(huì)形成菌絲，短時(shí)間內(nèi)長(zhǎng)出孢子，顏色為黑、白、綠、黃。

3 脫毒馬鈴薯試管苗污染的常見原因

3.1 苗源與苗源瓶受到污染

苗源瓶?jī)?nèi)的苗源受到雜菌的侵染，因?yàn)槭歉腥境跗冢催^小，一般難以被肉眼發(fā)現(xiàn)。將其接種到培養(yǎng)基瓶?jī)?nèi)將會(huì)導(dǎo)致更多苗源瓶感染。苗源瓶常常攜帶有一些雜菌、細(xì)菌、真菌、霉菌，原因在于表面消毒不充分徹底。在接種操作時(shí)容易被帶入接種瓶，導(dǎo)致感染。

3.2 培養(yǎng)基帶菌

培養(yǎng)基需通過濕熱滅菌法處理，但偶爾有部分耐高溫雜菌不會(huì)被殺死，或者在高壓滅菌處理培養(yǎng)基時(shí)滅菌不徹底導(dǎo)致部分雜菌殘留。通過高壓消毒的培養(yǎng)基未緩放3～4d，在高壓消毒后就開始接種，因此，帶菌的培養(yǎng)基直接被用于接種，從而導(dǎo)致人為感染[3]。

3.3 操作傳染與氣流帶菌

工作人員在開展接種工作時(shí)自身攜帶細(xì)菌或者使用器械消毒處理不徹底帶菌。如，工作人員在對(duì)雙手消毒時(shí)不徹底、不仔細(xì)，對(duì)剪刀、鑷子等器械消毒不到位，容易將細(xì)菌帶到培養(yǎng)基上。氣流傳菌主要是接種室與組培室內(nèi)空氣中存在一些雜菌。當(dāng)工作人員在接種操作的過程中大聲講話，拿放物體不輕緩，從而容易造成脫毒苗與培養(yǎng)基再次受到污染。

4 防范對(duì)策

4.1 接種前徹底清除污染菌源

4.1.1 清除容器雜菌

要確保容器清潔，在清洗前需將污染的與未污染的容器分開再進(jìn)行清洗。清洗后的玻璃容器要發(fā)亮，瓶壁沒有掛水珠，內(nèi)外壁水膜均勻。工作人員在拿取容器時(shí)注意盡量不要碰到內(nèi)壁。瓶蓋也需仔細(xì)刷洗，待晾干后與瓶子存放在一邊備用。

4.1.2 清除水質(zhì)雜菌

選用蒸餾水配制培養(yǎng)基母液，并且將母液放在4℃的冰箱內(nèi)保存。盡量用蒸餾水或純凈、無色透明、無懸浮物的食用水制作培養(yǎng)基，最大限度避免菌源與雜菌感染。灌裝培養(yǎng)基操作要干凈利索，確保瓶口與瓶壁未與培養(yǎng)基發(fā)生黏結(jié)，迅速封口，并及時(shí)滅菌。嚴(yán)格執(zhí)行濕熱滅菌操作，等鍋內(nèi)壓力增至0.5kg·cm-2時(shí)將排氣閥打開，待冷空氣全部排完后，將排氣閥關(guān)閉確保壓力保持在1.1kg·cm-2左右，溫度調(diào)節(jié)為120～121℃，滅菌時(shí)間保持20～25min，最多為30min，從而防止造成培養(yǎng)基成分改變[4]。

4.1.3 選用無污染培養(yǎng)基

培養(yǎng)基經(jīng)過徹底滅菌處理后需轉(zhuǎn)移至無菌室，在常溫條件下放置3～4d，篩選出有雜菌污染的培養(yǎng)基，將其剔除，最后留下干凈無菌的培養(yǎng)基用于接種。

4.1.4 接種室要保證干凈清潔

在每次開始接種前先用紫外線燈對(duì)工作臺(tái)與接種室內(nèi)環(huán)境進(jìn)行照射消毒，時(shí)間以20～30min為宜，用75%酒精進(jìn)行噴霧處理。通常隔5～7d對(duì)接種室進(jìn)行徹底消毒1次，按照1∶3的比例配制高錳酸鉀與甲醛溶液，在室內(nèi)熏蒸10～12h，以徹底消滅空氣中的各種菌源。要求工作人員的工作服、帽子、口罩都必須保證干凈，定期予以消毒。對(duì)消毒鍋要經(jīng)常進(jìn)行檢查，評(píng)估滅菌效果，一旦發(fā)現(xiàn)問題應(yīng)馬上進(jìn)行檢修。

4.2 嚴(yán)格遵循無菌要求開展接種操作

對(duì)待轉(zhuǎn)基礎(chǔ)苗要反復(fù)觀察，確認(rèn)沒有污染才可以取用。利用酒精棉充分擦拭待轉(zhuǎn)苗瓶的外側(cè)與瓶蓋，以清除附著在上面的雜菌，再將其放置于無菌室。工作人員需洗手更換衣服戴好口罩方可進(jìn)入無菌室，進(jìn)入室內(nèi)后使用75%酒精再次對(duì)手進(jìn)行消毒，才能開展下一步工作[5]。

選用75%酒精作為消毒劑，清潔工作臺(tái)面與臺(tái)壁。注意超凈工作臺(tái)上面不可堆放太多的物品，苗源瓶(基礎(chǔ)苗)、接種瓶均不宜放置太多，容易引起氣流不通暢，從而導(dǎo)致操作區(qū)的空氣凈化不完全，造成不可避免的污染。對(duì)接種器械要進(jìn)行徹底滅菌處理，將鑷子、支架、剪刀等工具放在酒精燈外焰上來回消毒，由正到反，從外到內(nèi)均要消毒，然后放在一旁晾涼。開始接種時(shí)工作人員要把瓶口接近酒精燈火焰，完成一瓶接種后，需重新對(duì)全部工具進(jìn)行徹底消毒方可進(jìn)行下一瓶接種。工作人員在接種操作時(shí)要做到動(dòng)作迅速、規(guī)范、熟練，禁止與他人講話，避免造成污染。接種完畢后必須將培養(yǎng)基瓶口進(jìn)行嚴(yán)密的封閉處理，從而盡量阻止瓶?jī)?nèi)與室內(nèi)空氣間形成對(duì)流，從而防范氣流傳菌。

4.3 嚴(yán)密防范內(nèi)生細(xì)菌

Wilson對(duì)內(nèi)生菌的定義為：在整個(gè)或部分生活周期中侵染活的植物體，但不會(huì)導(dǎo)致植物組織出現(xiàn)明顯癥狀的微生物，主要包括細(xì)菌與真菌。材料內(nèi)部所帶細(xì)菌大多潛伏較深，常規(guī)的表面消毒防范難以將其徹底清除，伴隨材料一同參與到培養(yǎng)過程中，進(jìn)而導(dǎo)致組培污染[6]。

有的時(shí)候在外植體的初級(jí)培養(yǎng)過程中難以察覺內(nèi)生細(xì)菌，通過逐步繁殖，菌量會(huì)逐漸增多，最終在培養(yǎng)基上顯現(xiàn)出來。就污染狀態(tài)分析可知，內(nèi)生菌污染多見于植物材料的四周，通常從培養(yǎng)基內(nèi)往外部伸展，其發(fā)生時(shí)間一般在4d以上，菌的種類也比較單一，而接觸性細(xì)菌通常在2～4d就會(huì)有所癥狀。

對(duì)此，可將相關(guān)抑菌劑或抗生素加入到培養(yǎng)基中，低溫預(yù)處理、減小pH值等措施，用于防范細(xì)菌等內(nèi)生菌的污染。在運(yùn)用抗生素抑菌時(shí)應(yīng)注意以下幾點(diǎn)：對(duì)癥下藥，不可隨意使用抑菌劑；選擇最合適的抑制濃度；了解抗生素在培養(yǎng)基上面能否起效，穩(wěn)定性是否良好；確保抗生素對(duì)植物不會(huì)產(chǎn)生不良影響。此外，應(yīng)按合理的流程開展擴(kuò)大繁殖工作。獲得脫毒試管苗后需要選取一部分留作“原種”進(jìn)行儲(chǔ)存，通過分批繁殖與復(fù)檢確定無問題后才能擴(kuò)大栽植規(guī)模。

4.4 加強(qiáng)接種后的管理

4.4.1 人員管理

杜絕非工作人員進(jìn)入，工作人員在進(jìn)入前需做好清潔措施，穿戴專門的工作服，套上鞋套，避免將外部雜菌帶入。

4.4.2 定期消毒

2～3d對(duì)地面消毒1次，消毒劑選用百菌清或甲醛溶液，每周用甲醛熏蒸1次，操作流程為：取50mL甲醛溶液與15g高錳酸鉀，將二者混合，并將接種室門窗密閉24h，散發(fā)出來的甲醛蒸汽可以清除空氣中的相關(guān)細(xì)菌與真菌。同時(shí)，用75%酒精進(jìn)行噴霧處理。

4.4.3 剔除受污染的瓶苗

要及時(shí)將培養(yǎng)室內(nèi)發(fā)生污染的瓶苗剔除，通過高壓鍋對(duì)污染苗進(jìn)行滅菌處理再進(jìn)行遠(yuǎn)距離統(tǒng)一銷毀，徹底清除病毒源。對(duì)于非常珍貴、稀少的瓶苗發(fā)生污染時(shí)，若污染程度輕微應(yīng)采取相應(yīng)的挽救措施。先把瓶苗從培養(yǎng)室中移出，并用酒精棉遮擋污染部位，剪掉植株頂部，然后將75%酒精作為沖洗劑，沖洗30s左右，并用無菌水沖洗2遍。對(duì)容器表面徹底消毒后轉(zhuǎn)移至超凈工作臺(tái)，并用0.1%的Hg2CL2溶液浸泡約5～10min，用無菌水沖洗5遍，轉(zhuǎn)移至新培養(yǎng)基上。經(jīng)凈化處理的材料需要單獨(dú)保存，與其它脫毒苗分開，觀察數(shù)日判斷沒有污染方可轉(zhuǎn)移到原處保存。為強(qiáng)化滅菌效果，一般可選擇混合消毒液進(jìn)行消毒，或多次消毒的辦法。若消毒效果不好，可加入適量的抗生素在培養(yǎng)基中。

綜上所述，要根據(jù)試管苗被污染的常見原因采取有效的應(yīng)對(duì)措施，盡快構(gòu)建起一套完善的預(yù)防馬鈴薯脫毒試管苗工廠化生產(chǎn)污染問題的相關(guān)機(jī)制，為實(shí)現(xiàn)馬鈴薯的豐產(chǎn)豐收打好基礎(chǔ)。