長鏈非編碼RNA與先天腭裂畸形的關系研究進展

唐璟，宋慶高

腭裂是常見的頜面部先天缺陷，可單獨發生，也可與唇裂合并或作為遺傳綜合征的一部分出現。腭裂與唇腭裂由于病因及胚胎發育起源的相似性而密切相關。腭裂患者因腭部裂隙及腭咽閉合不全，導致嚴重的語音、飲食障礙及頜骨發育不良。給患者及家庭帶來巨大的心理和經濟負擔。目前，腭裂的潛在病因尚未明確，先天缺陷的形成機制尚不清楚。研究認為，腭裂是復雜的多基因遺傳因素與環境因素共同作用的結果［1］。胚胎腭突間充質細胞(embryo palatal mesenchymal cell，EPMC）的分化增殖和正中嵴上皮細胞（medial edge epithelial cell，MEEC）的轉歸是腭突融合的關鍵步驟。特定的信號通路和基因表達通過與細胞間的信息交流控制著腭突融合的每一步。腭部的發育需要對基因表達進行精確的時空調控，這是由錯綜復雜的轉錄因子網絡及其相應的DNA 基序控制的。任何對此網絡的微小干擾都可能導致腭裂的發生。非編碼RNA（non-coding RNA，ncRNA）在腭發育過程中扮演著重要的角色。對全基因組關聯研究（genome-wide association study，GWASs）數據進行分析時發現，80%以上的疾病相關遺傳位點位于蛋白質編碼基因之外［2］，這表明非編碼基因在腭裂的發生發展中起著重要作用。長鏈非編碼RNA（long non-coding RNA，lncRNA）是非編碼RNA中重要的一類，與腭裂的發生密切相關。lncRNA 可發揮競爭性內源RNA（competitive endogenous RNA，ceRNA）功能，其與微小 RNA（microRNA，miRNA）結合形成的 lncRNA-miRNA 表達模式在唇腭裂與正常的組織細胞中有著顯著差異，提示它們可能通過參與調控某些生物過程的特定靶基因和信號表達，從而在唇腭裂的形成和調控機制中發揮重要作用［3］。本文將在現有研究的基礎上對與腭裂有關的lncRNA 作用機制及lncRNA-miRNA 相關調控網絡進行綜述，旨在為腭裂的發病機制研究提供新的參考和視角。

1 上腭的發育過程

腭部組織可分為前腭突與側腭突，前腭突源于原始口腔前界的胚胎額鼻突，而側腭突則由原始口腔兩側的上頜突生長形成，在腭突發育初期，未分化的EPMC 可大量增殖。此時的舌體發育很快，幾乎充滿原始口腔，使最初向中線方向生長的兩側腭突只能向下垂直生長，位于舌的兩側。隨后，由于下頜骨的生長發育及腭突體積增大等因素，舌體的形態逐漸扁平，側腭突上升到舌背上方的水平位置，并向中線生長，兩側腭突開始接觸，并與前腭突和鼻中隔相融合。在雙側腭突發生接觸后，通過MEEC 的遷移、自噬、凋亡及上皮-間充質轉化（epithelial mesenchymal transition，EMT），其緊密粘連形成正中上皮帶（medial epithelial seam，MES），隨后MES逐漸變薄形成上皮條索，而條索斷裂后成為上皮島，最終完全消失，形成完整的口腔頂部［4-5］。由上可知，腭部的發育有著精確的時空順序，對其發育過程任何環節的干擾都可能引起腭裂的發生。

2 LncRNA及競爭性內源RNA概述

LncRNA 是長度大于200 個核苷酸的非編碼RNA，其能以多種調節方式參與胚胎發育、細胞的增殖分化和疾病的發生發展［6］。LncRNA 主要通過以下3 種方式參與基因網絡調控［7］。（1）轉錄水平。部分lncRNA基因在自身轉錄時，可干擾下游基因的轉錄，從而影響mRNA 的生成，調控蛋白編碼基因表達。（2）轉錄后水平。lncRNA 可作為 ceRNA 與miRNA結合，在轉錄后水平間接調節miRNA參與的生物學過程。（3）表觀遺傳學水平。lncRNA 可影響基因甲基化修飾，調控下游基因表達。

曾有學者提出了ceRNA 假說來解釋lncRNA、miRNA和mRNA之間的作用，認為lncRNA擁有類似miRNA反應元件，可以作為ceRNA與miRNA競爭性結合，降低miRNA 對靶基因mRNA 的抑制作用，從而調節編碼基因的表達水平，形成跨轉錄組的大規模調控網絡［8］。因此，lncRNA與miRNA的相互作用關系逐漸成為研究熱點，其ceRNA-miRNA-mRNA模式反映了不同RNA之間的調節對話新方式，極大拓寬了人類基因組遺傳信息的功能，并在胚胎生長發育、疾病發生轉歸等生理、病理過程中發揮重要作用［9-10］。

近年來，對 lncRNA、lncRNA-miRNA 調節軸的探索主要集中于腫瘤等疾病領域，相關研究結果預見其可作為生物分子標志物對腫瘤的早期篩查、診療和藥物使用有較大幫助［11-12］。目前，先天性發育畸形的患病率仍然很高，但有關lncRNA-miRNA 調節軸在胚胎生長發育方面的研究報道卻較少。非編碼RNA 對顱面發育有重要的調節作用，lncRNA、miRNA 均可調控細胞增殖、分化等相關生物過程，且它們的調控可相互依存、相互交織，共同形成復雜而精細的調控網絡以參與顱面的發育［13-14］。顯然，lncRNA-miRNA在先天發育畸形領域的作用有待更深的挖掘。

3 LncRNA導致腭裂發生的機制

目前，越來越多的證據顯示，lncRNA 在胚胎生長發育的生物過程中發揮重要作用，人類異常的lncRNA 表 達 可 導 致 多 種 疾 病 發 生 發 展［15-16］。lncRNA 可通過調控腭發育過程中的關鍵基因影響細胞的分化增殖、凋亡遷移及相關生物過程，從而在腭裂的發生發展中發揮重要作用。

3.1 LncRNA 調控腭胚間充質細胞的分化增殖 EPMC 的分化增殖是腭突生長的關鍵。抑制EPMC的增殖可使腭架的生長延緩，甚至停滯，無法接觸融合，從而導致腭裂的發生。LncRNA H19 在多種組織細胞中表達，與大多數疾病密切相關。在全反式維甲酸（atRA）誘導的腭裂小鼠模型中，lncRNA H19 與其靶基因胰島素樣生長因子（insulin-like growth factor，IGF2）表達呈顯著的負相關，IGF2是胚胎發育過程中組織細胞增殖和分化所必需的生長因子，lncRNA H19 通過調控IGF2抑制EPMC 增殖，進而抑制腭突的上抬及水平生長［17-18］。Gao等［19］在對2，3，7，8-四氯二苯并-二噁英（TCDD）誘導的腭裂小鼠研究中同樣發現，lncRNA H19高表達可抑制IGF2基因，他們認為lncRNA H19 和IGF2的甲基化狀態可能發生了改變，其異常表達可抑制EPMC的增殖，延緩腭架的生長，從而導致腭裂的發生。LncRNA Meg3 可通過轉化生長因子-β（transforming growth factor-beta，TGF-β）/Smad 信號通路來調節細胞的增殖、分化和相關生物過程［20］。在 atRA 處理的 EPMC 中，lncRNA Meg3 啟動子中特定的CpG 位點去甲基化，使得lncRNA Meg3 表達上調，通過負調控Smad2蛋白信號的表達而抑制EPMC的分化增殖，進而抑制腭突的生長［21］。

3.2 LncRNA影響EMT EMT是腭突融合的重要過程，也是腭形成過程中的關鍵步驟。TGF-β 信號通路已被證實可廣泛參與腭突的融合過程，其調控的關鍵因子Smad和Snail在EMT過程中發揮著重要作用。研究發現，lncRNA H19可在TGF-β3基因缺失后的腭裂形成中通過Smad 信號途徑調控EMT 和細胞凋亡來阻礙腭突的融合［22］。可見，lncRNA H19在腭發育的各個階段都發揮著重要作用。在TCDD誘導的腭裂小鼠模型中，對子代腭裂組織進行高通量測序并且構建lncRNA和mRNA的共表達網絡，結果發現顯著差異表達的7 個lncRNAs 在骨形態發生蛋白（bone morphogenetic protein，BMP）信號通路中富集；BMP信號通路與腭裂形成密切相關，是TGF-β超家族的成員，其同樣作用于下游Smad 蛋白，影響EMT過程；該研究發現LncRNA ENSMUST00000193657、MSTRG. 56310.1、MSTRG. 13399.1 上 調 ，LncRNA MSTRG.51656.1、MSTRG.40182.1、MSTRG.38487.1、MSTRG.1991.1 下調，可能通過靶向結合Smad1和Smad5抑制EMT作用，從而誘導腭裂發生［23］。

3.3 LncRNA參與細胞的自噬和凋亡 細胞的自噬和凋亡參與腭部的發育。AMBRA1基因處于自噬和凋亡之間，控制自噬和凋亡之間的相互轉換，決定細胞的死亡或存活［24］。Shu 等［25-26］發現一個與腭裂相關的lncRNA NONMMUT034790.2-LEF1-AMBRA1反式調節網絡共表達下調，其中淋巴增強因子1（lymphoid enhancement factor 1，LEF1）參與腭裂的形成，可與Smad3顯著富集于EMT 的生物學過程。AMBRA1 介導的自噬促進EMT 的誘導，而TGF-β/Smad3信號通路在調節自噬誘導的EMT中起著關鍵作用。AMBRA1調控NONMMUT034790.2 通過這一反式調節網絡介導EMT相關的自噬和凋亡，可能是腭裂融合功能障礙的重要機制。轉錄因子LEF1可調控lncRNAs 和基因表達，形成NONMMUT034790.2-LEF1-Smad7 共表達反式調節網絡［27］。其中Smad7可通過Wnt 信號中的轉錄調節因子與LEF1相互作用，并通過TGF-β 通路誘導細胞凋亡，參與EMT 過程。lncRNA NONMMUT034790.2、LEF1、Smad7可能在“lncRNA-TF-靶基因”的反式調節機制下介導MEEC的凋亡，抑制EMT作用，從而導致腭突融合失敗。由上可知，lncRNA NONMMUT034790.2-LEF1-Smad7 共表達反式調節網絡與腭裂的形成有關，lncRNA NONMMUT034790.2 可能成為腭裂新的表觀遺傳標志。

4 LncRNA作為ceRNA在腭裂中的表達研究

LncRNA 作為 ceRNA 可與 miRNA 相互作用，形成lncRNA-miRNA 調節軸，通過相關信號通路及與基因的相互作用來參與腭部發育，從而影響腭裂的發生發展。

4.1 動物實驗研究 Prkar1α 是編碼蛋白激酶A（PKA）的一個調控亞基，可在胚胎發育過程中調節神經嵴細胞的形成、遷移和分化，影響顱面的發育，參與cAMP 依賴性蛋白激酶活性的負調節途徑［28］。研究報道，在atRA誘導的腭裂小鼠模型中通過生物信息學分析確定了69個lncRNAs、18個miRNAs和78個mRNAs 的異常表達，其中NONMMUT004850.2、NONMUT024276.2和Prkar1α表達上調，而miR-741-3p和miR-465b-5p表達下調［29］。通過構建ceRNA網絡 功能 分 析，Shu 等［29］認 為 NONMMUT004850.2/NMMUT024276.2 作為 miR-741-3p/miR-465b-5p 的ceRNA 可通過調控 Prkar1α 表達，負調節 PKA 活性，從而阻斷腭突融合，NONMMUT004850.2/NMMUT024276.2-miR-741-3p/miR-465b-5p-Prkar1α可能參與調節腭部發育融合過程。

在GWASs 中發現存在較多與顱面發育相關的潛在致病單核苷酸多態性（SNP）位點，且鑒定出的大多數變異體都位于非編碼RNA 區域內［30］。lncRNA RP11-462G12.2 中的rs2262251被認為是非綜合征型唇腭裂的潛在致病SNP。SNPrs2262251可影響EPMC 及唇組織中lncRNA RP11-462G12.2的結構和表達，通過熒光素酶報告發現帶有rs2262251C 等位基因的 lncRNA RP11-462G12.2 可直接靶向結合IQSEC2，lncRNA RP11-462G12.2 的過表達降低了miR-744-5p 的內源表達，導致IQSEC2上調，從而促進細胞凋亡，抑制細胞增殖，表明包含rs2262251C 等位基因的lncRNA RP11-462G12.2 是一種新的miR-744-5p 海綿，可能調控IQSEC2在唇腭裂發生發展過程中的表達，這種關系可能產生一個lncRNA-miRNA基因調節軸［31］。

4.2 臨床研究 Li 等［32］研究對比了唇腭裂患者與正常人外周血提取的ncRNA，結果發現兩者存在明顯的表達差異。Gao 等［3］在唇腭裂和腭裂患者外周血中鑒定了差異表達的ncRNAs 和mRNAs，并利用生物信息學方法探索了ncRNAs的潛在功能和關聯，構建了以 lncRNA 為誘餌、miRNA 為中心、mRNA 為靶點的lncRNA-miRNA-mRNA 調控網絡，結果顯示，唇腭裂組與對照組相比，共有36 個lncRNAs、1 341 個 mRNAs 和 60 個 miRNAs 有表達差異；腭裂組與對照組相比有 57 個lncRNAs、1 255 個 mRNAs和162 個miRNAs 有表達差異。可能在腭裂和唇腭裂的病理中起重要作用的ncRNAs 和mRNAs 包括：miR-483-3p、miR-92b-5p、miR-4690-3p、miR-654-3p、miR-16-5p、lncRNA rP11-731F5.2、lncRNA XIST、lncRNA rP11-591c20.9 以及 RARA、SMAD2、BAG5、ZEB2 等［33］。值得注意的是，miR-92b-5p 的靶基因lncRNA XIST在腭裂組的表達明顯上調，lncRNA rP11-731F5.2 與 miR-483-3p、BAG5、ZEB2間也存在較高的相關性，且lncRNA rP11-731F5.2靶基因RARA在網絡中具有更多的邊緣聯系。由此可見，全轉錄組各基因相互調控、相互聯系，形成了復雜的調控網絡系統。上述研究表明，對于頜面部lncRNA-miRNA 的生物信息學分析可以推測大量lncRNA-miRNA 調節網絡與腭裂的發生密切相關，但其潛在作用機制還待進一步驗證。

5 總結與展望

近年來，lncRNA、miRNA 研究已成為基因調控領域的研究熱點。通過總結腭裂中lncRNA 的作用機制及lncRNA-miRNA基因調控網絡的研究進展發現，lncRNA 作為調控網絡的重要參與者，因其結構復雜性和功能多樣性提供了多種關于lncRNA 和miRNA 在腭裂中的調控機制，lncRNA 和 miRNA 有可能作為腭裂的早期疾病篩查、診斷和防治的潛在標志物。隨著對調控網絡的深入研究，將為腭裂的病因探索提供更為豐富的研究思路和更為有效的研究方法，同時為進一步研究腭裂中ncRNAs 和mRNAs的潛在調控機制奠定了基礎。然而，lncRNA和miRNA的相互調控網絡復雜，其在腭裂發生中的作用機制仍處于探索階段，大多數lncRNA 與miRNA 在腭裂中的調控機制尚不明確，已知的lncRNA-miRNA-mRNA 調控網絡有限，故需要更先進有效的研究技術及方法對lncRNA 的結構功能和調控機制進行系統研究，發現更多有意義的lncRNA-miRNA 調節軸，以便更深入揭示lncRNA-miRNA基因調控網絡在腭裂發生發展中的作用機制，為腭裂畸形的病因研究、早期篩查及防治靶點提供新的途徑。