玉米中隱蔽性毒素和新型毒素污染情況分析——基于2020年中國玉米主產區采樣情況

張大偉，楊海麟*，華 宇，周 旌，李安平，關 舒，安 綱，寧 霄

（1. 江南大學 生物工程學院/江南大學教育部工業微生物技術重點實驗室，江蘇 無錫 214122；2. 羅瑪實驗室檢測服務（無錫）有限公司，江蘇 無錫 214101；3. 百奧明飼料添加劑（無錫）有限公司，江蘇 無錫 214101；4. 中國食品藥品檢定研究院，北京 100050）

玉米是一種重要的糧食作物，無論是作為直接的產品，還是由玉米制作而成的加工品或生產的副產品都有較高的附加值，帶來了很高的經濟效益，我國是全球第二大玉米生產國，其中西南、華北和東北地區的種植面積占全國的70%以上[1]。然而玉米無論在種植環節還是在儲藏環節非常容易受到真菌毒素的污染，據全球糧農組織預測，全球大于25%的谷物都或多或少遭受真菌毒素侵害，從而帶來了巨大的經濟損失。

真菌毒素（mycotoxins）是特定霉菌在一定條件下產生的小分子次生代謝產物[2-3]，在谷物中十分普遍，不僅給人畜健康帶來巨大威脅，也會造成嚴重的經濟損失[4]。真菌毒素種類繁多，目前監管和研究工作主要集中在黃曲霉毒素（AFT），赭曲霉毒素（OT），伏馬毒素（FUM），玉米赤霉烯酮（ZEN）以及脫氧雪腐鐮刀菌烯醇（DON）等。其中，黃曲霉毒素 B1（AFB1）分布最廣且毒性最強，其致癌、致突變、致畸性均居首位，屬于1類致癌物[5]；FUM 種類繁多，其中伏馬菌素B1（FB1）和B2（FB2）的污染最為廣泛，屬2B類致癌物[6-7]；ZEN又稱F-2毒素，是人體的內分泌干擾物[8]；DON 則是B族單端孢霉烯族毒素的一種，其靶標器官是胃腸道系統，單端孢霉烯族B毒素還包括15-乙酰基嘔吐毒素和3-乙酰基嘔吐毒素等。這些真菌毒素除 FUM 外均具有脂溶性，不僅廣泛污染谷物，還可通過污染谷物制成的飼料傳遞給牲畜，因此也存在于肉、蛋、奶等動物產品中。

目前無論是企業還是政府監管部門更多的是關注食品或飼料法律法規中存在限量標準的真菌毒素，隨著檢測技術的不斷發展，一些新型真菌毒素和隱蔽型真菌毒素逐漸引起人們的關注，因缺乏合適的分析方法和系統充足的風險評估數據，鮮見相關法規與限量標準。谷物中主要的新型真菌毒素包括白僵菌素（BEA）、恩鐮孢素（ENN）、Fusaproliferin（FUS）、串珠鐮刀菌素（MON）、桔霉素（CIT）、雜色曲霉毒素（STG）及鏈格孢毒素等。其中MON的毒性很強，與T-2相當，主要靶標器官是心臟[9]；CIT常與OTA共存增強其致癌性[10]；STG是AFB1合成的前體化合物，被歸為 2B類致癌物[11]。隱蔽型真菌毒素則是動植物體在受到外源毒素侵害時，將母體毒素與糖、氨基酸及硫酸鹽等結合生成的衍生物[12]；此外一些食品加工過程如發酵及熱處理也可以提高隱蔽型毒素的含量[13]。目前，谷物中檢測到的隱蔽型真菌毒素主要有 DON的葡萄糖苷衍生物（DON-3G，DON-15G），ZEN 的葡糖苷衍生物（ZEN-4G）以及硫酸鹽衍生物（ZEN-14S）等[14]。隱蔽型毒素通常具有與其母體相似或較低的毒性作用，但當其生物利用率更高時則會表現出比母體更強的毒性作用[15]。

Romer labs是全球真菌毒素檢測的領導者，于 1982年建立了全球第一家真菌毒素檢測實驗室，通過近四十年的積累發展成為世界上診斷技術及檢測服務領域專業的實驗室之一，奧地利總部一直致力于多毒素檢測方法的開發，研究利用Romer Labs總部開發的40+真菌毒素液相色譜質譜聯用方法檢測了 2020年的 181份飼用玉米樣品，重點對于嘔吐毒素和玉米赤霉烯酮的隱蔽性毒素以及一些新型毒素進行了研究分析，為科研工作提供一定的參考。

1 材料與方法

1.1 試驗材料

玉米樣品，每份樣品500～1 000 g，來源于田間采樣和養殖戶或飼料生產企業用作飼料原料：百奧明公司抽檢的9個地區總共181個樣本（見表1）；真菌毒素標準物質：奧地利ROMER公司；甲醇、乙腈、乙酸、（色譜級）、純水、乙酸銨（質譜級）：德國默克公司。

表1 樣品來源分布Table 1 Distribution of samples

1.2 儀器與設備

RAS Mill研磨機：奧地利 ROMER公司；Agilent 1290-Sciex QTRAP 5500高效液相色譜-串聯質譜儀：美國安捷倫公司和美國SCIEX公司；Milli-Q超純水儀：德國默克密理博公司；BSA2202S-CW 分析天平：德國賽多利斯公司；Pico-17離心機：美國賽默飛公司；RO500震蕩器：德國格哈特公司。

1.3 試驗方法

1.3.1 樣品前處理方法

將玉米樣品研磨過 20目篩混合均勻。稱取10 g（精確至0.01 g）于250 mL三角燒瓶中，準確加入30 mL提取液，V(乙腈)∶V(水)∶V(甲酸)=79∶20∶1，以 180 r/min振搖 2 h，然后以4 000 r/min離心6 min后取100 μL上清液，加入600 μL稀釋液混勻后用高效液相色譜–串聯質譜儀進行檢測分析。

1.3.2 色譜條件

飛諾美Gemini C18 column（150 x 4.6 mm i.d.5 μm），柱溫 40 ℃，流速 0.5 mL/min；進樣量20 μL；流動相A為含5 mmol乙酸銨的0.5%乙酸水溶液，流動相B為含5 mmol乙酸銨的0.5%乙酸的甲醇溶液。梯度洗脫條件如表2所示。

表2 梯度洗脫程序Table 2 Gradient elution program %

1.3.3 質譜條件

掃描模式：多反應監測（multiple reaction monitoring，MRM）模式；離子源：電噴霧電離ESI；正離子模式電噴霧電壓：5 000 V，離子源溫度：650 ℃；負離子模式電噴霧電壓：–4 500 V，離子源溫度：600 ℃；碰撞氣：中等；Gas1：55 psi，Gas 2：65 psi；氣簾氣：30.0 psi；其他質譜條件見表3。

表3 質譜條件Table 3 Mass spectrometry conditions

續表3

1.4 數據分析

利用office2019軟件中Excel進行統計分析。

2 結果與分析

2.1 質譜圖情況

將 44種毒素混合標準溶液通過自動進樣器進樣，經色譜柱分離后注入ESI離子源，在上述條件下得到相應毒素的多反應監測色譜圖，如圖1-2。色譜峰形對稱尖銳，表明該方法穩定可靠，有利于玉米中真菌毒素的檢測。

圖1 真菌毒素混合標準溶液在ESI+模式下的多反應監測色譜圖Fig.1 Multiple-reaction monitoring chromatograms of mixes solution of mycotoxin standards in ESI+

2.2 嘔吐毒素相關隱蔽性真菌毒素發生情況

隨著對真菌毒素研究的深入，近年的研究發現某些真菌毒素可與一些極性較強的物質結合，這類結合態的真菌毒素是常規手段很難檢測到的，但是在遇到消化酶或腸道微生物時會部分或全部釋放，進入動物體內，當其生物利用率高時，會表現出比母體更強的毒性作用，嚴重危害畜禽健康。本次研究主要關注含量較高的嘔吐毒素-3-葡萄糖苷（D3G）及嘔吐毒素的兩種乙酰基化合物：15-乙酰基嘔吐毒素（15 AcDON）和3-乙酰基嘔吐毒素（3 AcDON）。這些被檢樣品中，嘔吐毒素-3-葡萄糖苷檢出率最高，其中陽性最高值為412 μg/kg，而陽性均值最高為 152 μg/kg。3-乙酰基嘔吐毒素檢出率最高檢出率較低，最高地區僅為17%；陽性最高值和陽性均值最高分別為21、18 μg/kg；有3個地區未檢出3-乙酰基嘔吐毒素。詳細情況如圖3、表4所示。

圖3 隱蔽型毒素檢出率Fig.3 Occurrence data of masked-mycotoxin

表4 隱蔽性毒素數據Table 4 Masked-mycotoxin in corn μg/kg

2.3 新型毒素和其他類毒素發生情況

隨著檢測技術的不斷發展，一些新型的真菌毒素逐漸引起人們的關注。谷物中主要的新型真菌毒素包括白僵菌素（BEA）、恩鐮孢素（ENN）、串珠鐮刀菌素（MON）、雜色曲霉菌素（STC）、霉酚酸（MPA）越來越多的引起科研工作者的關注，除此以外像α-玉米赤霉烯醇（α-zearalenol，α-ZOL）、β-玉米赤霉烯醇（β-zearalenol，β-ZOL）、玉米赤霉酮（Zearalanone，ZAN）這些玉米赤霉烯酮代謝產物以及以鏈格孢酚（AOH）為代表的鏈格孢霉毒素也時有報道。雖然這些真菌毒素暫時沒有進行常規的分析檢測，更沒有受到法規的管制，但是有證據表明，這些新型的真菌毒素不僅種類多，而且很可能產生協同作用，從而對食品和飼料安全產生更大影響。

在這些毒素中，白僵菌素檢出率為 67%～100%。恩鐮孢素A檢出率最高為23%；恩鐮孢素A1檢出率最高為13%；恩鐮孢素B檢出率最高為23%，有2個地區均未檢出；恩鐮孢素B1檢出率最高為14%，有2個地區未檢出。串珠鐮刀菌素檢出率為78%～100%；霉酚酸檢出率最高為33%，2個地區未檢出；雜色曲霉菌素檢出率最高為100%，2個地區均未檢出；α-玉米赤霉烯醇檢出率最高為 41%，2個地區未檢出；玉米赤霉酮檢出最高為 32%，2個地區未檢出；格列孢酚均有檢出，但檢出率較低，為 8%～22%。詳細情況如圖4所示。

圖4-1 白僵菌素和恩鏈孢霉檢出率Fig.4-1 Occurrence data of emerging-toxins such as BEA & ENN

圖4-2 其他毒素以及部分毒素代謝物檢出率Fig.4-2 Occurrence data of other toxins and its metabolite in maize

2.3.1 白僵菌素發生情況

白僵菌素能夠提高陽離子穿過細胞膜的能力，由此干擾正常生理水平下的陽離子濃度，影響細胞膜的電化學濃度，從而產生毒性反應。此外，白僵菌素還可以誘導染色體畸變，姐妹染色單體交換和微核形成，最終引起細胞凋亡，線粒體功能異常和紅細胞膜變形等現象。本次研究白僵菌素的均值最大為 70.2 μg/kg，最低為 1.3 μg/kg。詳細情況見表5。

表5 白僵菌素數據Table 5 Beauverin data in maize μg/kg

2.3.2 恩鐮孢素發生情況

恩鐮孢素目前發現的有20多種，研究較多的主要有恩鐮孢素 A、恩鐮孢素 A1、恩鐮孢素 B和恩鐮孢素B1這四種，對人和動物有致癌、致畸、致突變等毒性。本次研究涉及的樣品中，恩鐮孢A最高值為 361.0 μg/kg，陽性均值為 128.0 μg/kg；恩鐮孢 A1最高值為 13.9 μg/kg，陽性均值為8.4 μg/kg；恩鐮孢B最高值為9.8 μg/kg，陽性均值為 1.8 μg/kg；恩鐮孢 B1最高值為 7.8 μg/kg，陽性均值為2.1 μg/kg。有2個地區未檢出恩鐮孢素。詳細情況見表6。

表6 恩鐮孢素數據Table 6 Enniatin data in maize μg/kg

2.3.3 串珠鐮刀菌素發生情況

串珠鐮刀菌素的毒性很強，主要的靶標器官是心臟。本研究涉及的樣品中，最高值和陽性均值最大分別為953、140 μg/kg。最高值和陽性均值最小值分別為113、31.3 μg/kg。詳細情況見表7。

表7 串珠鐮刀菌素數據Table7 Moniliformin data in maize μg/kg

2.3.4 雜色曲霉菌素和霉酚酸發生情況

雜色曲霉菌素是AFB1合成的前體化合物，也是2B類致癌物。霉酚酸是免疫抑制劑，能阻斷T和B淋巴細胞的增殖，抑制抗體形成和產生毒性T細胞[19]。本次研究涉及的樣品中，雜色曲霉菌素最高值和陽性均值最高分別為8.4、2.9 μg/kg，有2個地區未檢出。霉酚酸最高值和陽性均值最高分別為57.3、18.1 μg/kg，有2個地區未檢出。詳細情況見表8。

表8 雜色曲霉菌素和霉酚酸數據Table 8 Sterigmatocystin & Mycophenolic acid data in maize μg/kg

2.3.5 α-玉米赤霉烯醇、β-玉米赤霉烯醇和玉米赤霉酮發生情況

α-玉米赤霉烯醇、β-玉米赤霉烯醇和玉米赤霉酮為玉米赤霉烯酮的代謝產物，與動物內源性雌激素β-雌二醇有類似的化學結構，故可以與動物細胞內β-雌二醇的受體結合而引起牲畜雌激素綜合癥狀，導致牲畜體內雌激素過多，引起不孕不育、流產和死胎現象，并有很強的致癌性。α-玉米赤霉烯醇最高值和陽性均值最高分別為13.2、13.2 μg/kg，有1個地區未檢出；β-玉米赤霉烯醇最高值和陽性均值最高分別為8.0、5.3 μg/kg，有3個地區未檢出；玉米赤霉酮最高值和陽性均值最高分別為12.5、12.5 μg/kg，有2個地區未檢出。詳細情況見表9。

表9 α-玉米赤霉烯醇、β-玉米赤霉烯醇和玉米赤霉酮數據Table 9 α-zearalenol、β-zearalen & Zearalanone occurrence data in maize μg/kg

2.3.6 鏈格孢酚發生情況

鏈格孢酚是鏈格孢毒素的一種，對人和動物有致癌，致畸，致突變等毒性。鏈格孢酚是玉米中另一種常見的真菌毒素，絕對值不高，但本次研究涉及的樣品，均有微量檢出率。最高值和陽性均值最高分別為25.2、10.8 μg/kg。詳細情況見表10。

表10 鏈格孢酚數據Table 10 AOH Occurrence data in maize μg/kg

3 討論與結論

玉米是我國重要的糧食作物，同時也是重要的飼料和工業原料，因此明確玉米中的真菌毒素分布情況和風險隱患，對于促進其精準監管和科學防治，推動糧食產業結構調整與綠色發展，保障我國農產品質量安全與農業產業高質量發展具有重要意義。本研究利用利用同位素內標-高效液相色譜-串聯質譜法檢測了 2020年用于飼料原料的181份盲樣，數據表明隱蔽性毒素和新型毒素應該引起更為廣泛的關注。

嘔吐毒素的隱蔽性毒素由于其含有的糖苷基團或者乙酰基基團在進入人體和動物體內會在酶切作用下，還原為原型，因此其毒性也不能忽視，文獻中多有報道關于國內外玉米的嘔吐毒素隱蔽性毒素的暴露，例如Yan等2017年研究選取606個樣品中3-ACDON和15-ACDON檢出率分別為13.53%和 76.40%，陽性均值為 115、5 μg/kg[20]。歐盟食品安全評估委員會（EFSA）總結了歐洲各國關于隱蔽性毒素3-ACDON和15-ACDON以及DON-3G的數據，在谷物類原料中均有不同程度的檢出[21]。

白僵菌素和恩鐮孢霉作為重要的新型毒素主要由鐮刀菌的某些菌種侵染小麥、大麥、黑麥和燕麥等谷物后，在潮濕和溫度較低的條件下產生[22]，是最具有代表性的六酯肽類化合物。這類毒素具有基因和細胞毒性，可以誘導染色體畸變、姐妹染色體單體交換和微核形成[23]。Han等2017年檢測某省 71個玉米，其中白僵菌素檢出率為85.9%，陽性均值為 46.96 μg/kg。恩鐮孢霉 A、A1、B、B的檢出率依次為 2.8%、4.2%、0%和4.2%，陽性均值分別為 0.13、0.14、0.21 μg/kg[24]。C, Luz等綜述了白僵菌素在玉米、小麥、大麥等谷物中的檢出率情況，發現全球各國的白僵菌素均有不同程度的檢出[25]，因此白僵菌素的污染也應引起重視。

隨著檢測技術的發展以及人們對于越來越多真菌毒素的關注，使得我們把研究重點更多的聚集在國內隱蔽性毒素和新型毒素的陽性檢出率和檢出均值，以期為相關研究部門和監管單位提供更多的數據參考。本研究中所檢測樣品來自若干不同地區，僅用于科研分析，樣品未覆蓋國內所有玉米產地，且部分地區樣品數量相對較少，代表性弱，并不能全面反映這些地區2020年用于飼料原料的新玉米中真實的真菌毒素污染水平。本次分析的隱蔽性毒素和新型毒素的檢測數據僅供研究同行參考。

備注：本文的彩色圖表可從本刊官網（http:// lyspkj.ijournal.cn）、中國知網、萬方、維普、超星等數據庫下載獲取。